השיטות המתוארות כאן נוגעות לתרכובות שניתן להגדיר באופן מבצעי כשלימנים ימיים. הבסיס להגדרה זו הוא נוחותם להפקת נוזל נוזלי בממסים אורגניים שאינם קוטביים, המספקים אמצעי נוח להפרדתם מתרכובות אחרות במטריצה מימית. טבעם ההידרופובי מאפשר את בידודם ממי ים או מדגימות ביולוגיות, כמו גם את העשרתם והסרת מלחים וחלבונים.
עבור דגימות מי ים, הצעד הראשון בדרך כלל כרוך ההפרדה לשברים מומסים וחלקיקים המוגדרים מבחינה מבצעית, בדרך כלל על ידי סינון. שבר החלקיקים הוא שנשמר על-ידי מסננים, וגודל הנקבבובית חשוב בהגדרת הניתוק. באמצעות מלקחיים נקיים שומנים, מניחים מסנן סיבי זכוכית 47 מ"מ כי כבר אפר על מערכת סינון שומנים נקיים.
קח את המדגם וסובב אותה בעדינות כדי לתתבת מחדש את כל החלקיקים שאולי התיישבו. מדוד אמצעי אחסון ידוע. אמצעי האחסון יהיה תלוי בכמות חומר החלקיקים במדגם.
כאשר נמדד הנפח, הוסף יניקה למערכת הסינון והרטיב בעדינות את המסנן במי ים מסוננים. מוסיפים את כל המדגם לאט למשפך הסינון ושוטפים את הגליל המדורג במי ים כדי להבטיח שכל החלקיקים יוסיפו למסנן. יש לשטוף את משפך המנגנון כדי להבטיח שכל החלקיקים ישטפו כלפי מטה אל המסנן.
משוך את כל הנוזל דרך המסנן, אך אל תיתן למסנן להתייבש, מכיוון שהוא עלול לקרוע תאים הנמצאים על המסנן. קח את מלקחיים נקיים שומנים, לקפל את המסנן לשניים, ולאחר מכן לקפל אותו בשלישיות שוב, ולאחר מכן בחצי אורך. המסנן ממוקם לאחר מכן בוויון נקי שומנים.
מכסים את המסנן בשני מיליליטר של כלורופורם, מכסים מתחת לחנקן, וחותמים בנייר טפלון. בשלב זה, המדגם יהיה יציב באחסון במינוס 20 צלזיוס עד שנה. מכין את הדגימה.
מדוד נפח ידוע של הסינון לתוך גליל זכוכית נקייה שומנים. מניחים את הדגימה לתוך משפך הפרדה נקי שומנים, ולהוסיף כ 20 מ"ל של כלורופורם. לנער את התערובת הזאת לפחות שתי דקות אוורור לעתים קרובות.
לאחר ההפרדה הראשונה, הסרת תמצית ראשונה ותוספת של חומצה. לאחר ניעור הפתרון במשך שתי דקות, לעטוף את המשפך בנייר אלומיניום ולחכות עד ההפרדה התרחשה, כחמש דקות. לאחר המתנה להפרדה, לקלף בחזרה את החלק התחתון של רדיד האלומיניום כדי לראות את שתי השכבות.
אסוף את השכבה התחתונה לתוך בקבוקון עגול נקי שומנים, תוך נזהר לא לכלול אף אחת מהשכבה העליונה. מכסים את הבקבוקון העגול מתחת לחנקן, ומניחים במקפיא. לשחזר את משפך ההפרדה ולהוסיף חומצה גופרתית לנוזל.
מוסיפים 0.25 מ"ל לכל ליטר מי ים. לאחר החומצה הגופרתית נוספה, לנער את מי הים בעדינות, ולאחר מכן להוסיף עוד 10 מיליליטר של כלורופורם, ולנער במרץ תוך כדי אוורור במשך שתי דקות נוספות. אז לאפשר הפרדה.
הפרדות שניות ושלישיות. מוסיפים שוב את השכבה התחתונה לבקבוקון התחתון העגול מבלי לכלול מים. מוסיפים כמות שלישית של 10 מ"ל של כלורופורם ומנערים עוד שתי דקות עם האוורור.
לאחר ההפרדה, מניחים את החלק האחרון של כלורופורם באותו בקבוקון, ואת התמציות המשולבות ניתן לאדות על ידי מאייד סיבובי ומועבר לתוך בקבוקון שני מ"ל. ההתקנה. עבור ההתקנה החילוץ, תצטרך מיכל מבודד מלא בקרח. הממסים כוללים כלורופורם, מים המופקים כלורופורם, וכלורופורם-מתנול 2:1.
של פתרון זה, אתה צריך בערך אחד מיליליטר לדגימה, אז לעשות את זה בהתאם. כל הממיסים האלה צריכים להיות ממוקמים על קרח, כך שהם קרים עד החילוצים מתחילים. הדגימות גם ללכת על קרח, כך שהכל נשאר קר.
שחיקה וחילוץ. דגימות אוחסנו קפוא בשני מיליליטר של כלורופורם, אז להוסיף מ"ל אחד של מתנול קר כקרח או חצי צינור. היזהר בעת הוספת מתנול לא לגעת בלווייתן עם הצינור.
נקי והומוגני שלוש פעמים עם מתנול ושלוש פעמים עם כלורופורם. בעת שחיקה, להיזהר לא לחתוך את מחבת החילוץ ביד שלך במקרה שאתה לשבור את המשחקון כדי למנוע חימום המדגם. טוחנים מהר.
לאחר המדגם כבר הקרקע לחלוטין, לעמוד אותו בקרח ולשטוף את כל החלקיקים הנותרים מן המטחנה בחזרה לתוך הלווייתן באמצעות מ"ל של 2:1 כלורופורם-מתנול. במידת הצורך, יש להשתמש במלקחיים נקיים מכוסות כדי לאלץ חלקיקים לחזור לחקירה לפני הכביסה. היזהר לא לגעת בצינור לטחינה או במטחנה לתחינה.
לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר או רבע צינור של מים המופקים כלורופורם מבלי לגעת במטחנה או במטחנה לעלון. כאשר המטחנה נשטפה, לגעת טיפה תלויה מן המטחנה לקוסם. לכסות ולשמור אותו בקרח עד מוכן sonicate.
צנרת כפולה. לאחר הצנטריפוגה, יהיו שתי שכבות בוויאלי: השכבות האורגניות והמ מימיות. כדי לקבל את השכבה האורגנית, נעשה שימוש בטכניקת ההקטרה הכפולה.
כדי לעשות זאת, צינור קצר חמישה סנטימטרים עם הנורה לשים על רופף נתפס בין האצבע המורה והאצבע האמצעית. דוחפים בעדינות את הצינור דרך שתי השכבות תוך כדי לחיצה על הנורה וגורמים לבועות לצאת עד הסוף. כאשר מגיעים לתחתית השכבה השנייה, השתמש באגודל כדי לפוצץ את הנורה מבלי למשוך את השכבה האורגנית לתוך הצינור.
עם צינור של 9 ס"מ לסחוט את הנורה לחלוטין. שים את הקצה הארוך של הצינור לתוך צינור חמישה סנטימטרים ולהסיר את השכבה התחתונה דרך צינור חמישה סנטימטרים. תמצית זו ממוקמת לאחר מכן בחתינה נקייה שומנים.
המשיכו להסיר את השכבה התחתונה עד להסרתה. כל השכבות של בריכה בקסימה נקייה שומנים. שוטף צינורות.
הסר את הנורה מהצינור 9 ס"מ. מניחים אותו בוויאליה עם התמצית בתוכו. קח צינור מלא כלורופורם נקי, ובלי לגעת בצינור לזה שנשטף, התיז את הכלורופורם סביב החלק הפנימי של הצינור.
סובב בעדינות את הצינור בזמן הכביסה. קח צינור שני מלא בכלורופורם ולעשות את אותו הדבר לחלק החיצוני של הצינור. ודא כי כל כלורופורם רץ במורד הצינור לתוך מקטורן החילוץ.
כאשר סיים עם צינור ארוך, לקחת את הקצר ולחזור, אבל לשטוף את זה לתוך הבקבוקון עם המדגם. מאתר דגימה. נקה מזרק עם כלורופורם.
קח דגימה של נפח ידוע ולשטוף את המזרק במדגם. משוך את הדגימה מעבר לכמות שברצונך לזהות. ואז להביא את הבוכנה עד לכמות שאתה רוצה להבטיח אין בועות אוויר.
השתמש בכפתור כדי לחלק 0.5 מיקרוליטרים ולגעת בירידה למוט. אפשר להתייבש לפני הנחת הטיפה הבאה על אותה נקודה. לזהות את כל הדגימות בשורה על מוטות מוחזקים מעל הקצה של צלחת חמה חמה.
התמקדות באצטון. המיקוד של המדגם נעשה ב 100%אצטון. מוסיפים כ 70 מ"ל של אצטון לתחתית מיכל הפיתוח.
קח את שני המתלים והורד אותם בעדינות לתוך מיכל הפיתוח. צפה בחזית הממס כפי שהוא מטפס על המוט עד תחתית הנקודה מתמזגת עם החלק העליון של הנקודה. הסר את המוטות.
לייבש אותם במשך כחמש שניות, ולאחר מכן לחזור על ההליך. אם הדגימות מרוכזות מאוד, התמקדות זו יכולה להיעשות בפעם השלישית. מערכת פיתוח ראשונה.
מערכת הפיתוח הראשונה מורכבת מהקסאן, אתיל אתר וחומצה פורמית ב-98.5 ל-0.5. התחל על ידי שטיפה גליל מדורג שלוש פעמים עם hexane ו להשליך. מלא את הגליל מדורג קצת מעבר 85 מיליליטר עם hexane.
לאחר מכן להשתמש pipet ואת הבקבוק של hexane כדי למלא את הגליל מדורג ל 90 מיליליטר. לאחר מכן להביא את החלק התחתון של המניסקוס לקו 91 מ"ל באמצעות אתיל אתר, אשר ייתן אחד מיליליטר של אתר אתיל. מוסיפים 0.5 מ"ל של חומצה פורמית באמצעות מזרק המילטון.
אבל קודם לשטוף את מזרק המילטון שלוש פעמים עם חומצה פורמית כדי להבטיח כי אין כלורופורם ששימש לשטוף את המדגם מתוך המזרק נשאר. הוסף שני מזרקים מלאים או 25 מיקרוליטרים בכל פעם עבור סך של 50 microliters. חשוב כי חומצה פורמית הוא שטף מתוך המזרק מיד עם כלורופורם, כדי למנוע חלודה המתכת במזרק.
לאחר מזרק המילטון הוא נקי, להפוך את הפתרון עד בדיוק 100 מיליליטר באמצעות hexane וצינור. ואז כובע והפוך שלוש או ארבע פעמים. יוצקים פנימה כ-30 מ"ל לתוך מיכל הפיתוח.
השתמש 30 מ"ל זה כדי להרטיב את הנייר ולשטוף את המיכל. יש להשליך את תמיסת השטיפה. מוסיפים את 70 ה-MLS הנותרים למיכל הפיתוח.
הוספת ארונות תקשורת למערכת הפיתוח. הוספת מוטות למערכת הפיתוח זהה לכל התפתחות. ודא שהשעון מוגדר לזמן פיתוח המוטות.
ואז לקחת את המתלים ולהוריד אותם בעדינות לתוך הטנק. צפה עד חזית הממס מגיע כתמי מדגם, ולאחר מכן להפעיל את שעון התזמן. מערכת פיתוח שנייה.
מערכת הפיתוח השנייה היא הקסאן, אתילן וחומצה פורמית, 79 עד 20 לאחד. אז כמו קודם, לשטוף את הגליל מדורג שלוש פעמים עם hexane. מוסיפים בדיוק 20 מ"ל של אתר ולאחר מכן מ"ל אחד של חומצה פורמית, אשר מביא את הנפח ל 21 מיליליטר.
ואז להביא את הנפח ל 100 מיליליטר עם הקסאן. מוסיפים כ-75 מ"ל של הקסאן באמצעות משאבות הבקבוק. ולחלק, השתמש בצנרת.
כובע והפוך מספר פעמים. מוסיפים כ-30 מ"ל למיכל הפיתוח כדי להרטיב את הנייר ולשטוף את המיכל. להשליך את 30 מיליליטר.
מוסיפים את 70 הנותרים וזה מוכן לסט המוטות. מערכת פיתוח שלישית. מערכת הפיתוח השלישית היא תערובת של כלורופורם, מתנול ומים המופקים מכלורופורם, 50, 40 עד 10.
לשטוף את הגליל מדורג שלוש פעמים עם כלורופורם. מוסיפים כ-45 מ"ל של כלורופורם. בעזרת צינור, מביאים את תחתית המניסקוס לסימן ה-50 מ"ל.
מוסיפים כ-38 מ"ל של מתנול. מביאים את החלק התחתון של המניסקוס לקו 90 מ"ל. לאחר מכן מלאו את 10 ה"ל האחרונים במים המופקים בכלורופורם.
כמו במערכות הפיתוח האחרות, הפוך את זה שלוש או ארבע פעמים, ולאחר מכן לשפוך 30 מיליליטר לתוך המיכל כדי להרטיב את הנייר. להשליך כי 30 מ"ל ולהוסיף את 70 מ"ל האחרונים לתוך הטנק. מכין את המתנול.
כדי לפצות על פתרון Hilditch המשמש לגזרה, מלא בקבוקון נפחי נקי שומנים שגם הוא התייבש או שטף שלוש פעמים נוספות עם מתנול כדי להסיר כלורופורם. מוסיפים מתנול עד שתחתית המניסקוס נמצאת בקו המכיל. לאחר מדידת מתנול, להוסיף נתרן גופרתי כי כבר מיובש לפחות 24 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
מוסיפים מספיק נתרן גופרתי כך שהוא מכסה את החלק התחתון של בקבוקון מטרי נפח. לאחר כיסוי, הפוך פעמיים כך שכל מים כי הוא במתנול נספג על ידי נתרן גופרתי. לאחר היפוך ורעד, תן לו לשבת לפחות חמש דקות.
הוספת החומצה. לאחר המתנול התיישב חמש דקות, לאט לאט decant אותו לתוך בקבוק הזכוכית הסופי להבטיח את כל נתרן גופרתי נשאר בתחתית הבקבוק נפחי. הנתרן סולפט נשאר בדרך כלל בתחתית, כך שכל המתנול צריך לשפוך.
השאירו את הנפח עם הנתרן גופרתי בחלק האחורי של מכסה המנוע האדים לייבוש. לאט לאט להוסיף חומצה גופרתית למתנול באמצעות PIPETMAN. מוסיפים כמה טיפות בכל פעם כדי שהמתנול לא ירק.
לאחר שכל החומצה נוספה, מכסים ומערבבים בעדינות לערבב. הפתרון מוכן כעת לשימוש בנגזרים, אך יש לפצותו על בסיס שבועי. מה שהופך את הנגזרות.
מלוויון תמצית כי יש את הנפח הביא עד כמות ידועה, מערבולת, ולאחר מכן להסיר חלק של התמצית לתוך שומנים נקיים, מסומן 15 מ"ל מטען. הסכום שתסיר ייקבע על ידי ריכוז המדגם מהאיאטרוסקן. השתמש בצינור דראמונד נקי שומנים כדי להסיר את המדגם.
לאחר שהדגימה הוסרה, מניחים את 15 מ"ל בוחן מתחת לחנקן כדי לאדות לחלוטין את הכלורופורם. ניתן לשמור את הדגימה המקורית ולהחזירה למקפיא. כאשר המדגם מיובש, להוסיף 1.5 מיליליטר של dichloromethane או צינור אחד ושלושה מיליליטר של פתרון Hilditch כי היה מורכב מוקדם יותר באותו יום או שני צינורות.
פתרון זה נשמר לאחר מכן תחת חנקן, מערבולת ומונח ב sonicator במשך ארבע דקות לפני שהוכנס לתנור ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עוצר את התגובה. לאחר חימום ב 100 צלזיוס במשך שעה וקירור, לאט להוסיף 0.5 מיליליטר של פתרון ביקרבונט נתרן רווי.
בועות יופקו כמו החומצה מנוטרל. לאחר מכן להוסיף 1.5 מיליליטר של הקסאן. לסכם ולנער במרץ.
תן לו לעמוד כך שהוא ייפרד לשתי שכבות. עבד את כל הדגימות. עד שכולם יסיימו, הראשון יהיה מוכן לשלב הבא.
מסירים את השכבה העליונה. לאחר שהנגזרת נעצרה ויש הפרדה ברורה בלווייתן 15 מ"ל, הסר את השכבה העליונה והכניס אותה ללווייתן שני מ"ל נקי שומנים. עדיף להשאיר חלק מהשכבה העליונה מאשר להכניס את השכבה התחתונה לציפוי של שני מ"ל.
לאחר הסרת רוב השכבה העליונה, ניתן להשליך את שאר הפתרון. התמצית כי הוא שני מ"ל צריך להיות מתאדה לחלוטין תחת זרם עדין של חנקן. ברגע שהעליל יבש לחלוטין, ניתן לקרוא את ההקסאן, ואז המדגם צריך להיות sonicated, נשמר תחת חנקן, ואז הוא מוכן ללכת GC. תוצאות מייצגות.
נתון זה מראה כרומטוגמות TLC-FIC גולמיות ברמה שלנו, דיאטה העשויה משמן לפתית ורקמת כבד מסלמון שהאכיל את הדיאטה הזו. חקלאות ימית, מגזר ייצור המזון הצומח ביותר, צריכה להפחית את תלותה בדגים שמקורם בטבע ושמן דגים. שמנים צמחיים נחקרים כתחליף לשמן דגים במים.
וכבד, האתר העיקרי לחילוף חומרים שומנים בדם, מיועד לניתוח. אנו יכולים לראות את השכיחות של triacylglycerols בתזונה בכבד, וגם את החשיבות של פוספוליפידים ממברנה בכבד. איור זה מציג כרומטוגרמה של תקן.
שומנים וחלקיקים מתיישבים שנאספו מהחוף כאן ושומנים בתתבת שנאספו ליד אותו עומק. כאן, כרומטוגרמה עובדה באמצעות תוכנת התוויית. להיות פחמן עשיר עם ערך אנרגיה גבוה מאוד, שומנים הם מרכיב חשוב של הפרודוקטיביות של אזורי מדף, אשר חשובים במיוחד עבור רכיבה על אופניים פחמן.
ייצור ראשוני נוסף על פני השטח מגיע קרקעית הים במים רדודים יותר. גילינו שלתבת קטנה היה את ריכוז השומנים הגבוה ביותר בדגימות שלנו. שעווה ואסטרים סטריליים משולבים כאן.
ויש פיצול שיא בשל נוכחות של רמות גבוהות של חומצות שומן רב בלתי רוויות. המהירות שבה מערכת TLC-FID של Chromarod Iatroscan מספקת נתונים מסוג שומנים סינופטיים מדגימות קטנות הופכת אותו לכלי רב עוצמה להקרנת דגימות ימיות לפני ביצוע ניתוחים כרומטוגרפיים מפורטים יותר. ניתוחים כאלה דורשים בדרך כלל שחרור של תרכובות רכיבים מתמציות שומנים ותוצאת כדי להגביר את התנודתיות.
