ここで説明する方法は、海洋脂質として操作的に定義することができる化合物に関する。この定義の基礎は、非極性有機溶媒中の液体-液体抽出に対する無邪気さであり、水性マトリックス内の他の化合物からそれらを分離する便利な手段を提供する。その疎水性は海水または生物学的標本からの隔離、塩およびタンパク質の濃縮および除去を促進する。
海水サンプルの場合、最初のステップは通常、通常ろ過によって、操作的に定義された溶解および粒子状の分画に分離することを含む。粒子状の分率はフィルターによって保持されるものであり、そして、細孔サイズはカットオフを定義する上で重要である。脂質クリーンな鉗子を使用して、脂質クリーン濾過システム上に流された47ミリメートルガラス繊維フィルターを配置します。
サンプルを取り、穏やかにそれを渦巻き、落ち着いた可能性のある粒子を再懸濁させます。既知のボリュームを測定します。体積はサンプル中の粒子状物質の量によって異なります。
体積を測定したら、濾過システムに吸引を加え、ろ過された海水でフィルターを穏やかに濡らします。サンプル全体を濾過漏斗にゆっくりと加え、水で流し込み、すべての粒子がフィルターに追加されるようにします。装置の漏斗をすすいで、すべての粒子がフィルターにすすがっていることを確認します。
フィルターを通してすべての液体を引っ張りますが、フィルター上にある細胞を破裂させる可能性がありますので、フィルターを乾燥させないでください。脂質クリーンな鉗子を取り、フィルターを半分に折り、もう一度3分の1に折りたたみ、そして半分の縦に半分に折ります。フィルターは、次に脂質クリーンバイアルに配置されます。
フィルターに2mlのクロロホルムを覆い、窒素の下にキャップし、テフロンテープで密封します。この時点で、サンプルは最長1年間マイナス20°Cで安定しています。サンプルの準備をします。
脂質クリーンガラスの段階的なシリンダーに濾液の既知の体積を測定します。サンプルを脂質クリーンセパネルに入れ、約20mlのクロロホルムを加えます。この混合物を頻繁に通気する少なくとも2分間振る。
最初の分離後、第1抽出物の除去および酸の添加。溶液を2分間振った後、漏斗をアルミホイルで包み、分離が起こるまで約5分間待ちます。分離を待った後、アルミ箔の底を剥がして2つの層を見ます。
最下層を脂質クリーンな丸底フラスコに集め、最上層のいずれにも含めないように注意してください。丸底フラスコを窒素の下にキャップし、冷凍庫に入れる。セパレーター漏斗を回収し、液体に硫酸を加えます。
海水の各リットルに0.25 mlを追加します。硫酸を加えたら、海水を軽く振り、さらに10mlのクロロホルムを加え、さらに2分間通気しながら激しく振ります。その後、分離を許可します。
2 番目と 3 番目の分離。水を含まずに、底層を再び丸い底フラスコに加えます。クロロホルムの3分の1を加え、ベントでさらに2分間振ります。
分離後、クロロホルムの最終部分を同じフラスコに入れ、結合した抽出物をロータリーエバポレーターで蒸発させ、2mlバイアルに移すことができる。セットアップ。抽出の設定には、氷で満たされた断熱容器が必要です。溶媒としては、クロロホルム、クロロホルム抽出水、および2:1クロロホルムメタノールが挙げられる。
このソリューションでは、サンプルごとに約1mlが必要なので、それに応じてそれを作り上げ、これらの溶媒はすべて、抽出が開始されるまでに冷たくなるように氷の上に置く必要があります。サンプルも氷の上に行くので、すべてが冷たいままです。
研削および抽出。サンプルは2mlのクロロホルムで冷凍保存されているので、氷冷メタノールのmlを1mlまたは半分のピッド状に加えます。ピペットでバイアルに触れないようにメタノールを添加する際は注意してください。
メタノールで3回、クロロホルムで3回洗浄し、均質化します。粉砕する際は、バイアルを壊した場合に備えて抽出バイアルを手で切らないように注意し、サンプルを温めないようにしてください。すぐに粉砕します。
サンプルが完全に粉砕されたら、氷の中に置き、2:1クロロホルムメタノールのmlを使用して、グラインダーからバイアルに残っている粒子を洗浄します。必要に応じて、洗浄前に粒子をバイアルに強制的に戻すために、脂質クリーンな鉗子のセットを使用してください。ピペットをグラインダーやグラインダーに触れないように注意してください。
その後、グラインダーまたはグラインダーをバイアルに触れることなく、0.5mlまたはクロロホルム抽出水の4分の1のパイプを加えます。グラインダーを洗浄したら、グラインダーからバイアルに吊り下げたドロップをタッチします。キャップし、超音波処理する準備ができるまで氷の中に保管してください。
ダブルピペット。遠心分離の後、バイアルには有機層と水層の2つの層があります。有機層を得るために、二重ピペット法が使用される。
そのために、電球をゆるく置いた短い5センチメートルのピペットが人差し指と中指の間でつかまれる。電球を絞りながら、パイプを2つの層にそっと押し下げ、最後まで泡が出ます。2 番目のレイヤーの底に達したら、親指を使って、有機層をピペットに描画せずに電球をポップオフします。
9センチメートルのピペットで電球を完全に絞ります。ピペットの長い端を5センチメートルのピペットに入れ、5センチメートルのピペットを通して底の層を取り除きます。この抽出物は、次に脂質クリーンバイアルに入れ.
一番下のレイヤーがすべて削除されるまで引き続き取り外します。脂質クリーンバイアルにプールされたすべての層。パイプを洗う。
9センチのピペットから電球を取り外します。その中に抽出物とバイアルにそれを置きます.きれいなクロロホルムのパイプを取り、洗浄されたものにピペットに触れることなく、ピペットの内側の周りにクロロホルムを噴出します。
洗濯しながら、そのパイプをそっと回します。クロロホルムの第二のパイプを取り、パイプの外側に同じことを行います。すべてのクロロホルムがピペットを下り、抽出バイアルに入ることを確認してください。
長いピペットで終わったら、短いものを取り、繰り返しますが、サンプルでバイアルにこれを洗います。サンプルを見つける。クロロホルムで注射器を清掃します。
既知の容積のサンプルを取り、サンプル中の注射器をすすいでください。見つけたい量を超えてサンプルを引っ張ります。その後、気泡を確実にしたくない量にプランジャーを下ろします。
0.5マイクロリットルを分配し、ロッドにドロップをタッチするボタンを使用してください。次のドロップを同じ場所に置く前に乾燥させます。暖かいホットプレートの端に保持ロッド上のラインにすべてのサンプルを見つけます。
アセトンに焦点を合わせる。サンプルの焦点合わせは100%アセトンで行われます。開発タンクの底部に約70mlのアセトンを加えます。
2つのラックを取り、開発タンクにそっと下げます。スポットの底がスポットの上部と合流するまで、ロッドを登る際に溶剤の前面を見てください。ロッドを取り外します。
約5秒間乾燥させ、手順を繰り返します。サンプルが非常に濃縮されている場合、この焦点を3回目に行うことができます。初めての開発システム。
最初の開発システムは、ヘキサン、エチルエーテル、ギ酸で98.5~1~0.5で構成されています。まず、ヘキサンで卒業したシリンダーを3回すすいで捨てます。ヘキサンで85 mlsを少し超えて卒業したシリンダーを埋めます。
その後、90 mlsに卒業したシリンダーを埋めるために、ピペットとヘキサンのボトルを使用します。その後、エチルエーテルを使用して91mlラインに半月板の底を持って来て、エチルエーテルの1mlを与えます。ハミルトンシリンジを使用して0.5mlのギ酸を加えます。
しかし、最初にハミルトンシリンジをギ酸で3回リンスして、注射器からサンプルをすすい取るために使用されたクロロホルムが残らないようにします。2つの完全な注射器または25マイクロリットルを同時に加え、合計50マイクロリットルを加えます。ギロホルムで直ちにギリンジからギロミン酸をすすいで、シリンジ内の金属を腐食させないことが重要です。
ハミルトンシリンジがきれいになったら、ヘキサンとピペットを使用して正確に100 mlsまでの溶液を作ります。その後、キャップをキャップし、3〜4回反転します。開発タンクに約30mlを注ぎます。
この30mlsを使用して紙を濡らし、タンクをすすきます。すすり溶液を破棄します。残りの70mlを開発タンクに加えます。
開発システムへのラックの追加。開発システムにロッドを追加することは、開発のたびに同じです。タイマーがロッドの開発時間に設定されていることを確認します。
そして、ラックを取り、タンクにそっと下げます。溶媒の前部がサンプルのスポットに達するまで見て、タイマーを開始します。第2の開発システム。
第2の現像系は、ヘキサン、エチレン、およびギ酸、79~20対1である。したがって、以前のように、ヘキサンで卒業したシリンダーを3回すすいでください。ちょうど20mlのエーテルを加え、ギ酸を1ml加え、21mlにボリュームを持って来ます。
その後、ヘキサンで100mlsにボリュームを持参してください。ボトルポンプを使用して約75mlのヘキサンを加えます。そして、部分については、ピペットを使用してください。
キャップと反転を数回行います。開発タンクに約30mlを加えて、紙を濡らし、タンクをすすきます。30mlを捨てます。
残りの70を追加し、それはロッドのセットの準備ができています。第3の開発システム。第3の現像系は、クロロホルム、メタノール、クロロホルム抽出水、50、40~10の混合物である。
クロロホルムで卒業したシリンダーを3回リンスします。クロロホルムを約45ml加えます。パイプを使用して、半月板の底を50mlのマークに持って来ます。
メタノールを約38ml加えます。メニスカスの底を90mlラインに持って行きます。その後、最後の10mlをクロロホルム抽出水で満たします。
他の開発システムと同様に、これを3〜4回反転し、タンクに30mlを注ぎ、紙を濡らします。その30 mlsを捨て、タンクに最後の70 mlsを加えます。メタノールを準備する。
誘導体化に使用されるHilditch溶液を構成するには、乾燥させたり、メタノールで余分に3回洗い流したクリーンなクリーンなボリュームフラスコを充填してクロロホルムを除去します。メタノールをメタノールを加えるが、半月板の底がラインを含むまで。メタノールを測定した後、60°Cで少なくとも24時間乾燥した硫酸ナトリウムを加えます。
量測定フラスコの底を覆うほどの硫酸ナトリウムを加えます。一度覆われた後、メタノール中の水が硫酸ナトリウムによって吸収されるように2回反転します。反転して振った後、少なくとも5分間座らせます。
酸を加えた。メタノールが5分落ち着いた後、ゆっくりと最後のガラス瓶にデカンを入れ、すべての硫酸ナトリウムが体積フラスコの底に留まる。硫酸ナトリウムは通常底に残るので、すべてのメタノールが注ぐ必要があります。
煙のフードの後ろに硫酸ナトリウムを含む容積物を乾燥させます。ピペットマンを使用してメタノールに徐々に硫酸を加えます。メタノールが吐かないように、一度に数滴を加えます。
すべての酸を加えたら、キャップを入れ、軽くかき混ぜて混ぜます。このソリューションはデリバティブに使用する準備が整いましたが、週単位で作成する必要があります。デリバティブを作る。
体積が既知の量まで持ち上げた抽出バイアルから、渦巻き、その後、抽出物の一部を脂質クリーンに除去し、15mlバイアルとマークする。除去する量は、Iatroscanからのサンプルの濃度によって決定されます。サンプルを除去するために、脂質をきれいにきれいなドラモンドのピペットを使用してください。
サンプルを取り出したら、15mlのバイアルを窒素の下に置き、クロロホルムを完全に蒸発します。元のサンプルは保持し、冷凍庫に戻すことができます。サンプルを乾燥させたら、1.5mlのジクロロメタンまたは1つのピッドフルと、その日より早く作り上げたヒルディッチ溶液の3mlまたは2つのピレットを加えます。
この溶液は窒素の下に保たれ、渦を発生させ、超音波処理器に4分間入れてから、1時間摂氏100度のオーブンに入れます。反応を停止します。100°Cで1時間加熱し、冷却した後、0.5mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液をゆっくりと加えます。
酸が中和されると気泡が生成されます。その後、1.5 mlsのヘキサンを加えます。要約と激しく振る。
2つの層に分かるように立たせます。すべてのサンプルを処理します。それらがすべて終了する頃には、最初のステップは次のステップに向けて準備が整います。
最上層を削除しています。誘導体化が停止し、15 mlバイアルに明確な分離が存在したら、最上層を取り除き、脂質クリーンな2mlバイアルに入れます。最上層の一部を残すよりも、2 ml バイアルに一番下の層のいずれかを取得する方が良いです。
一番上の層の大部分が削除されると、ソリューションの残りの部分は破棄できます。2 ml に含まれる抽出物は、窒素の穏やかな流れの下で完全に蒸発する必要があります。.バイアルが完全に乾燥したら、ヘキサンを再び添加し、サンプルを超音波処理し、窒素の下に保管し、GCに行く準備が整います。代表結果。
この図は、私たちの標準の生のTLC-FICクロマトグラム、その食事を与えられたサケから菜種油と肝臓組織で作られた食事を示しています。最も急成長している食品生産部門である養殖は、野生産の魚粉や魚油への依存を減らさねる必要があります。植物油は、アクアフィードの魚油の代替品として調査されています。
そして、脂質代謝の主要部位である肝臓は、分析の対象となる。我々は、肝臓の食事中のトリアシルグリセロールの有病率を見ることができます, また、肝臓の膜リン脂質の重要性.この図は標準のクロマトグラムを示しています。
ここで沖合から採取した脂質と沈降粒子と、同じ深度付近のマイシド中の脂質を採取した。ここで、クロマトグラムはプロットソフトを通して処理されています。炭素が多く、エネルギー値が非常に高いため、脂質は棚領域の生産性の重要な要素であり、炭素循環にとって特に重要です。
より多くの表面一次生産は、浅い水の海底に到達します。我々は、小さなマイシドが我々のサンプル中で最も高い脂質濃度を持っていることを発見した。ワックスと滅菌エステルを組み合わせてご紹介します。
そして、高レベルの多価不飽和脂肪酸の存在によるピーク分割があります。クロマロッド・イアトロスカンTLC-FIDシステムが小さいサンプルからのシノプティック脂質クラスデータを提供する急速性は、より詳細なクロマトグラフィー分析を行う前に海洋サンプルをスクリーニングするための強力なツールです。このような分析は、通常、揮発性を高めるために脂質抽出物および誘導体化からの成分化合物の放出を必要とする。
