Determinação de Aulas De Lipídios e Lipídios Totais em Amostras Marinhas

Os métodos descritos aqui dizem respeito a compostos que podem ser operacionalmente definidos como lipídios marinhos. A base dessa definição é sua comodidade à extração líquido-líquido em solventes orgânicos não polares, o que fornece um meio conveniente de separá-los de outros compostos em uma matriz aquosa. Sua natureza hidrofóbica facilita seu isolamento da água do mar ou espécimes biológicos, bem como seu enriquecimento e remoção de sais e proteínas.

Para amostras de água do mar, o primeiro passo normalmente envolve a separação em frações dissolvidas e partículas definidas operacionalmente, geralmente por filtragem. A fração de partículas é aquela retida por filtros, e o tamanho dos poros é importante na definição do corte. Usando fórceps limpos lipídicos, coloque um filtro de fibra de vidro de 47 milímetros que foi ashed em um sistema de filtragem limpo lipídico.

Pegue a amostra e gire-a suavemente para resuspensar todas as partículas que possam ter se resolvido. Meça um volume conhecido. O volume dependerá da quantidade de material particulado na amostra.

Quando o volume for medido, adicione sucção ao sistema de filtragem e molhe suavemente o filtro com água do mar filtrada. Adicione toda a amostra lentamente ao funil de filtragem e enxágue o cilindro graduado com água do mar para garantir que todas as partículas sejam adicionadas ao filtro. Enxágüe o funil do aparelho para garantir que todas as partículas sejam enxaguadas no filtro.

Puxe todo o líquido através do filtro, mas não deixe o filtro secar, pois pode romper células que estão no filtro. Pegue as fórceps limpas lipídicas, dobre o filtro ao meio, depois dobre-o em terços mais uma vez e, em seguida, ao meio do comprimento. Em seguida, o filtro é colocado em um frasco limpo de lipídios.

Cubra o filtro com dois mls de clorofórmio, tampa sob nitrogênio e vedação com fita Teflon. Neste ponto, a amostra estará estável em armazenamento a menos 20 Celsius por até um ano. Preparando a amostra.

Meça um volume conhecido do filtrado em um cilindro graduado em vidro limpo lipídeo. Coloque a amostra em um funil separador limpo de lipídios e adicione aproximadamente 20 mls de clorofórmio. Agite esta mistura por pelo menos dois minutos ventando com frequência.

Após a primeira separação, remoção do primeiro extrato e adição de ácido. Depois de agitar a solução por dois minutos, enrole o funil em papel alumínio e espere até que a separação tenha ocorrido, aproximadamente cinco minutos. Depois de esperar pela separação, retire a parte inferior da folha de alumínio para ver as duas camadas.

Colete a camada inferior em um frasco de fundo redondo limpo lipídeca, tomando cuidado para não incluir nenhuma camada superior. Tampe o frasco de fundo redondo sob nitrogênio, e coloque em um congelador. Recupere o funil separador e adicione ácido sulfúrico ao líquido.

Adicione 0,25 mls para cada litro de água do mar presente. Uma vez adicionado o ácido sulfúrico, agite a água do mar suavemente, depois adicione mais 10 mls de clorofórmio, e agite vigorosamente enquanto ventilar por mais dois minutos. Então permita a separação.

Segunda e terceira separações. Adicione a camada inferior ao frasco fundo redondo novamente sem incluir água. Adicione uma terceira quantidade de 10 mls de clorofórmio e agite por mais dois minutos com ventilação.

Após a separação, coloque a porção final de clorofórmio no mesmo frasco, e os extratos combinados podem ser evaporados por evaporador rotativo e transferidos para um frasco de dois ml. Configuração. Para a configuração de extração, você precisará de um recipiente isolado cheio de gelo. Os solventes incluem clorofórmio, água extraída de clorofórmio, e clorofórmio-metanol 2:1.

Desta solução, você precisa de aproximadamente um ml por amostra, então coma-a em conformidade. Todos esses solventes devem ser colocados no gelo para que estejam frios quando as extrações forem iniciadas. As amostras também vão para o gelo para que tudo permaneça frio.

Moagem e extração. Amostras foram armazenadas congeladas em dois mls de clorofórmio, então adicione um ml de metanol gelado ou meio tubo. Tenha cuidado ao adicionar o metanol para não tocar no frasco com a tubulação.

Limpe e homogeneize três vezes com metanol e três vezes com clorofórmio. Ao moer, tenha cuidado para não cortar o frasco de extração na mão no caso de quebrar o frasco e evitar aquecer a amostra. Moer rapidamente.

Uma vez que a amostra tenha sido completamente moída, suporte-a no gelo e lave todas as partículas restantes do moedor de volta para o frasco usando um ml de clorofórmio-metanol 2:1. Se necessário, use um conjunto de fórceps limpos lipídicos para forçar as partículas de volta ao frasco antes de lavar. Tenha cuidado para não tocar na tubulação do moedor ou do moedor para o frasco.

Em seguida, adicione 0,5 mls ou um quarto de tubulação de água extraída de clorofórmio sem tocar no moedor ou no moedor ao frasco. Quando o moedor for lavado, toque na gota pendurada no moedor até o frasco. Cap e mantê-lo no gelo até pronto para sonicar.

Pipetação dupla. Após a centrifugação, haverá duas camadas no frasco: as camadas orgânicas e aquosas. Para obter a camada orgânica, a técnica de pipetação dupla é usada.

Para isso, uma tubulação curta de cinco centímetros com a lâmpada colocada livremente é agarrada entre o dedo indicador e o dedo médio. Empurre suavemente o tubo para baixo através das duas camadas enquanto aperta a lâmpada fazendo com que bolhas saiam até o final. Quando a parte inferior da segunda camada for atingida, use o polegar para tirar a lâmpada sem desenhar a camada orgânica na tubulação.

Com uma tubulação de nove centímetros esprema a lâmpada completamente. Coloque a extremidade longa da tubulação na tubulação de cinco centímetros e remova a camada inferior através da tubulação de cinco centímetros. Este extrato é então colocado em um frasco limpo lipídicos.

Continue a tirar a camada inferior até que tudo seja removido. Todas as camadas de agrupamento no frasco limpo lipídicos. Lavando cachimbos.

Remova a lâmpada da tubulação de nove centímetros. Coloque-o no frasco com o extrato nele. Pegue um tubo cheio de clorofórmio limpo, e sem tocar na tubulação para aquele que está sendo lavado, esguiche o clorofórmio ao redor do interior da tubulação.

Gire suavemente essa pipeta durante a lavagem. Pegue um segundo tubo cheio de clorofórmio e faça a mesma coisa do lado de fora da tubulação. Certifique-se de que todo o clorofórmio escorre pela tubulação e pelo frasco de extração.

Quando terminar com a tubulação longa, pegue a curta e repita, mas lave-a no frasco com a amostra. Detectando uma amostra. Limpe uma seringa com clorofórmio.

Pegue uma amostra de volume conhecido e enxágue a seringa na amostra. Puxe a amostra além da quantidade que você deseja detectar. Em seguida, leve o êmbolo para baixo para a quantidade que você quer garantir nenhuma bolha de ar.

Use o botão para distribuir 0,5 microliters e toque na haste para a haste. Deixe secar antes de colocar a próxima gota no mesmo local. Localmente todas as amostras em uma linha em hastes realizadas sobre a extremidade de uma placa quente quente.

Focando em acetona. O foco da amostra é feito em 100% de acetona. Adicione aproximadamente 70 mls de acetona ao fundo do tanque de desenvolvimento.

Pegue os dois racks e abaixe-os suavemente no tanque de desenvolvimento. Observe a frente do solvente enquanto sobe a haste até que a parte inferior do ponto se funda com a parte superior do ponto. Remova as hastes.

Seque-os por cerca de cinco segundos e repita o procedimento. Se as amostras estiverem muito concentradas, esse foco pode ser feito uma terceira vez. Primeiro sistema de desenvolvimento.

O primeiro sistema de desenvolvimento consiste em hexano, éter etílico e ácido fórmico de 98,5 a 1 a 0,5. Comece enxaguando um cilindro graduado três vezes com hexano e descartando. Encha o cilindro graduado um pouco além de 85 mls com hexano.

Em seguida, use uma pipeta e a garrafa de hexano para encher o cilindro graduado a 90 mls. Em seguida, leve o fundo do menisco para a linha de 91 ml usando éter etílico, que dará um ml de éter etílico. Adicione 0,5 mls de ácido fórmico usando a seringa Hamilton.

Mas primeiro enxágue a seringa Hamilton três vezes com o ácido fórmico para garantir que nenhum clorofórmio que foi usado para enxaguar a amostra dos restos da seringa. Adicione duas seringas completas ou 25 microliters de cada vez para um total de 50 microlitres. É importante que o ácido fórmico seja enxaguado da seringa imediatamente com clorofórmio para evitar corroer o metal na seringa.

Uma vez que a seringa Hamilton esteja limpa, faça a solução até exatamente 100 mls usando hexano e uma tubulação. Então cap e inverter três ou quatro vezes. Despeje aproximadamente 30 mls no tanque de desenvolvimento.

Use estes 30 mls para molhar o papel e enxaguar o tanque. Descarte a solução de enxágue. Adicione os 70 ml restantes ao tanque de desenvolvimento.

Adicionando racks ao sistema de desenvolvimento. Adicionar hastes ao sistema de desenvolvimento é o mesmo para todos os desenvolvimentos. Certifique-se de que o temporizador está definido para o tempo que as hastes devem ser desenvolvidas.

E, em seguida, pegue os racks e abaixe-os suavemente para dentro do tanque. Observe até que a frente do solvente atinja os pontos de amostra e inicie o temporizador. Segundo sistema de desenvolvimento.

O segundo sistema de desenvolvimento é o hexano, o etileno e o ácido fórmico, 79 a 20 a um. Assim como antes, enxágue o cilindro graduado três vezes com hexano. Adicione exatamente 20 mls de éter e, em seguida, um ml de ácido fórmico, que leva o volume a 21 mls.

Em seguida, leve o volume para 100 mls com hexano. Adicione cerca de 75 mls de hexano usando as bombas de garrafa. E para a porção, use uma pipeta.

Cap e inverter várias vezes. Adicione aproximadamente 30 ml ao tanque de desenvolvimento para molhar o papel e enxaguar o tanque. Descarte os 30 mls.

Adicione os 70 restantes e está pronto para o conjunto de hastes. Terceiro sistema de desenvolvimento. O terceiro sistema de desenvolvimento é uma mistura de clorofórmio, metanol e água extraída de clorofórmio, 50, 40 a 10.

Enxágüe o cilindro graduado três vezes com clorofórmio. Adicione cerca de 45 mls de clorofórmio. Usando uma pipeta, leve o fundo do menisco para a marca de 50 ml.

Adicione cerca de 38 mls de metanol. Traga o fundo do menisco para a linha de 90 ml. Em seguida, encha os últimos 10 mls com água extraída de clorofórmio.

Como com os outros sistemas de desenvolvimento, inverta isso três ou quatro vezes, e depois despeje 30 mls no tanque para molhar o papel. Descarte esses 30 mls e adicione os últimos 70 mls no tanque. Preparando o metanol.

Para compor a solução Hilditch usada para derivação, encha um frasco volumoso limpo e limpo lipídeca que também foi seco ou enxaguado três vezes mais com metanol para remover qualquer clorofórmio. Adicione metanol até que o fundo do menisco esteja na linha de contenção. Depois de medir o metanol, adicione sulfato de sódio que foi seco por pelo menos 24 horas a 60 graus Celsius.

Adicione sulfato de sódio suficiente para cobrir a parte inferior do frasco métrico de volume. Uma vez coberto, inverta duas vezes para que qualquer água que esteja no metanol seja absorvida pelo sulfato de sódio. Depois de inverter e tremer, deixe descansar por pelo menos cinco minutos.

Adicionando o ácido. Depois que o metanol se estabeleceu cinco minutos, lentamente decanta-o na garrafa de vidro final garantindo que todo o sulfato de sódio permaneça na parte inferior do frasco volumoso. O sulfato de sódio geralmente permanece na parte inferior, então todo o metanol deve derramar.

Deixe o volumoso com o sulfato de sódio na parte de trás do capô de fumaça para secar. Adicione lentamente ácido sulfúrico ao metanol usando um PIPETMAN. Adicione algumas gotas de cada vez para que o metanol não cuspa.

Uma vez que todo o ácido tenha sido adicionado, tampa e mexa suavemente para misturar. A solução está agora pronta para ser usada para derivativos, mas deve ser feita semanalmente. Fazendo os derivados.

A partir de um frasco extrato que teve o volume trazido até uma quantidade conhecida, redemoinho, em seguida, remover uma parte do extrato em lipídio-limpo, marcado frasco de 15 ml. A quantidade que você remover será determinada pela concentração da amostra do iatroscano. Use uma pipeta Drummond limpa lipídica para remover a amostra.

Uma vez que a amostra tenha sido removida, coloque o frasco de 15 ml sob nitrogênio para evaporar completamente o clorofórmio. A amostra original pode ser mantida e devolvida ao congelador. Quando a amostra estiver seca, adicione 1,5 mls de diclorometano ou um pipetful e três mls da solução Hilditch que foi feita mais cedo naquele dia ou dois pipetfuls.

Esta solução é então mantida sob nitrogênio, vórtice e colocada no sonicator por quatro minutos antes de ser colocada em um forno a 100 graus Celsius por uma hora. Parando a reação. Depois de aquecer a 100 Celsius por uma hora e esfriar, adicione lentamente 0,5 mls de solução de bicarbonato de sódio saturado.

Bolhas serão produzidas à medida que o ácido for neutralizado. Em seguida, adicione 1,5 mls de hexano. Recapitulando e agite vigorosamente.

Deixe-o de pé para que se separe em duas camadas. Processe todas as amostras. Quando todos terminarem, o primeiro estará pronto para o próximo passo.

Removendo a camada superior. Uma vez que a derivatização tenha sido interrompida e haja uma separação clara no frasco de 15 ml, remova a camada superior e coloque-a em um frasco de dois ml limpo lipídicos. É melhor deixar um pouco da camada superior do que obter qualquer camada inferior no frasco de dois ml.

Uma vez que a maioria da camada superior tenha sido removida, o resto da solução pode ser descartada. O extrato que está no dois ml deve ser evaporado completamente sob um fluxo suave de nitrogênio. Uma vez que o frasco esteja completamente seco, o hexano pode ser reassurado, e então a amostra deve ser sônica, mantida sob nitrogênio, e então está pronta para ir para o GC. Resultados representativos.

Esta figura mostra cromatógramas TLC-FIC crus do nosso padrão, uma dieta feita com óleo de colza e tecido hepático de um salmão alimentado com essa dieta. A aquicultura, o setor de produção de alimentos que mais cresce, tem que reduzir sua dependência de farinha de peixe de origem selvagem e óleo de peixe. Óleos vegetais estão sendo investigados como substitutos do óleo de peixe em aquafeeds.

E o fígado, o local principal para o metabolismo lipídico, é alvo de análise. Podemos ver a prevalência de triaciglicerols na dieta no fígado, e também a importância de fosfolipídios de membrana no fígado. Esta figura mostra cromatogramas de um padrão.

Lipídios e partículas de assentamento coletadas ao largo da costa aqui e lipídios no mysid coletados perto da mesma profundidade. Aqui, cromotogramas foram processados através de software de plotagem. Sendo ricos em carbono com um valor energético muito alto, os lipídios são um componente importante da produtividade das áreas de prateleira, que são particularmente importantes para o ciclismo de carbono.

Mais produção primária de superfície atinge o fundo do mar em águas rasas. Descobrimos que o pequeno mysid tinha a maior concentração lipídica em nossas amostras. Cera e ésteres estéreis são combinados aqui.

E há um pico de divisão devido à presença de altos níveis de ácidos graxos poli-insaturados. A rapidez com que o sistema Chromarod Iatroscan TLC-FID fornece dados de classe lipídica sinóptica de pequenas amostras torna-o uma ferramenta poderosa para a triagem de amostras marinhas antes de realizar análises cromatográficas mais detalhadas. Tais análises geralmente requerem a liberação de compostos componentes de extratos lipídes e derivatização para aumentar a volatilidade.