Bu protokol, DNA hasarından sonra DNA ve rezeksiyonun selülo nicelesinde ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, hücreleri S ve G2 fazı ile sınırlayan ve bromodeoksikürin sinyalinin DNA ve rezeksiyondan elde edilmesini sağlayan hücre döngüsü işaretidir. Prosedürü gösterenler arasında baş araştırmacı Jean-Yves Masson ve doktora sonrası araştırmacı Sofiane Y.Mersaoui yer alacak.
Steril bir kültür başlığı altında çalışarak, gerekli birçok koşul için altı kuyulu bir tabağın her kuyusuna tek bir kapak parçası yerleştirin. Transfeksiyon veya ilaç tedavisi için yaklaşık 150.000 HeLa hücresi plaka. Üçüncü gün, BrdU ile 10 mikromolar son konsantrasyonda gece kuluçkasını takiben, plakaları toplam beş gri doz x-ışını ışınlama ile ışınlayın.
Işınlamadan sonra, üç saat boyunca% 5 karbon oksit nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede inkübasyon için plakaları iade edin. Ön ekstraksiyon için ortamı emiş edin ve hücreleri PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, iki mililitre ekstraksiyon öncesi tampon A ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde dört santigrat derecede kuluçkaya bırakın.
10 dakika sonra, A tamponunu aspire edin, iki mililitre sitoskeleton sıyırma tamponU B ekleyin ve inkübasyonu tekrarlayın. Ardından B tamponu dikkatlice emiş ve hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, kimyasal kaputun altına paraformaldehitin% 4'ünün iki mililitresini ekleyerek hücreleri sabitleyin.
Paraformaldehitin çıkarılmasından ve PBS ile yıkandıktan sonra, kapak kapaklarını eksi 20 santigrat derecede inkübasyon için% 100 soğuk metanol ile beş dakika boyunca örtün ve kapakları PBS ile iki kez yıkayın. Permeabilizasyon için, hücreleri oda sıcaklığında% 0.5 Tritan X-100 içeren iki mililitre PBS ile kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, kapakları iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
İmmünizasyon için, her kuyuya iki mililitre bloke tamponu ekleyin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, her kapak sarmalına 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapakları kare parafilm ile örtmek için cımbız kullanın ve kabarcıklar oluşturmamak için parafilm'i dikkatlice yerleştirin.
Daha sonra plakayı alüminyum folyoya örtün ve birincil antikoru bir gecede dört santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, parafilm karelerini çıkarın ve kapakları iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, her kapak kapağına 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve kapakları gösterildiği gibi bir kare parafilm ile örtün.
İkincil antikorun oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın ve folyo kullanarak plakayı ışıktan koruyun. Daha sonra kapakları iki mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın. Nükleer boyama için, her kapak kılıfı için iki mililitre DAPI çözeltisi ekleyin ve kapakları PBS ile yıkayın.
Mikroskop slaytlarına 10 ila 20 mikrolitre IF'ye özgü montaj ortamı ekleyin. Kapak kapağını kuyunun altından kaldırmak için iğneyi veya ince cımbızı kullanın. Bir kenarı kağıt havluya hafifçe dokunarak fazla sıvıyı dikkatlice lekeleyin ve kapakları mikroskop slaytlarına monte edin.
Görüntü alma ve analiz için, bu dosyaları CellProfiler'a alın ve benek sayma ardışık düzeni kullanarak analiz edin. Metin taslağında açıklanan ayarları kullanarak odakları tanımlamak için birincil nesneyi tanımlayın ve yoğunluğu ölçün. Işınlamadan sonra 5-bromo-2-prime-deoksiyuridin odak oluşumu ve çoğalan hücre nükleer antijen lekeleme temsili görüntüleri burada gösterilmiştir.
Oluşturulan tek iplikli DNA izleri farklı odaklar olarak görselleştirildi. Tanımlanan odaklar daha sonra ölçülmüş ve çekirdekteki bromodeoksikürin lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edilmiştir. Ko-boyama, homolog olmayan uç birleştirmesi nedeniyle kısa aralıklı rezeksiyon ile S fazından geçen hücreleri tanımlamak için bir anti-PCNA antikoru kullanılarak homolog rekombinasyonun uzun menzilli rezeksiyonu arasında farklılaşma gösterdi.
PCNA çekirdekte belirgindir ve oldukça yoğun bir lekeleme ile hücre döngüsünün S aşamasında maksimum ifadeye ulaşır. Değerlerdeki sonuç daha sonra PCNA pozitif ve PCNA negatif çekirdekleri arasında ayrım yapmak için bir dağılım olarak çizilir. PCNA negatif sonuçları, durumdan bağımsız olarak düşük BrdU sinyali nedeniyle BrdU yoğunluk tabanlı analize izin vermek için veri kümesinden kaldırılır.
PCNA negatif çekirdekleri, 900 keyfi birim brdU odaklarının bazal entegre yoğunluğunu barındırır ve bu değer PCNA pozitif çekirdeklerinde 1.800 AU'ya ulaşır. SiRNA kontrol durumunda, BrdU odaklarının çekirdek başına entegre yoğunluğu PCNA pozitif çekirdeğinde yaklaşık 1.500 AU'dur. Parp-1'in bir siRNA kullanılarak verimli bir şekilde devrilmesinden sonra, BrdU odaklarının yoğunluğunda yaklaşık 1.900 AU'ya önemli bir artış gözlendi.
Bu teknik, homolog rekombinasyonun ilk aşaması hakkında önemli içgörüler sağlayabilir, böylece bir proteinin onarım yolunun ilk adımında yer olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Ekstraksiyon öncesi tamponlar için kuluçka süresi kesinlikle tutulmalıdır. Bu arabelleklere aşırı maruz kalmak, aşırı hücre kopması ve arka plan sinyalinin artmasına neden olur.
