Bu metodoloji, temizleme protokolünün iyileştirilmesini Mesos PIM teknolojisinin optik kesitleme göz kabiliyeti ile birleştirerek mikrometrik çözünürlükte mezo skopik rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmemizi sağlar. Orijinal üç boyutlu doku organizasyonunu kaybetmeden masif kalp dokularını veya tüm fare kalplerini tek bir taramada tüm çözeltiyi görüntüleme imkanı sağlar. Kalp, tiro çözeltisinde yıkanmış proksimal aort ile kanüle edildikten ve 0.01 molar PBS'de% 4 Paraform aldehit ile sabitlendikten sonra, temizleme protokolüne başlamaya hazırdır.
Kalbi 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın. Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca PBS ve% 0.01 sodyum azidde dört santigrat derecede saklanabilir. Kalbi 20 mililitre hidrojel çözeltisi içinde, dört santigrat derecede üç gün boyunca 15 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin.
Bir kurutucu, vakum pompası ve kurutucuyu hem pompa bandına hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın. Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın. Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.
Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın. Pompayı kapatın ve kurutucunun düğmesini azot boru hattına açın. Ardından azot musluğunu açın.
Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın. Kalbi gazdan arındırılmış hidrojel çözeltisinde 37 santigrat derecede istirahatte yaklaşık üç saat boyunca tutun. Hidrojel uygun şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve temizleme çözeltisi ile şişedeki bir temizleme çözeltisine yerleştirin.
Arıtma prosedürünü hızlandırmak için şişedeki temizleme solüsyonunu her üç günde bir değiştirin. Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, şişeden çıkarın ve sallanma durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre ısıtılmış PBS'de yıkayın. Sarsıntı durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre bir X PBS T içinde tekrar yıkayın.
Numuneyi mililitre başına 0.01 miligram buğday tohumu aglutinin Alexa kat 633'te bir X PBS T'nin üç mililitresinde yedi gün boyunca oda sıcaklığında 50 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin. Yedi günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mililitre X PBS T içinde 24 saat çalkalayarak yıkayın. Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından her biri beş dakika boyunca 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın.
Kalbi her biri sekiz saat boyunca 0.01 molar PBS'de 20 ve% 47 TDE'de art arda inkübe edin. Ve son olarak, gerekli kırılma indisi 1.46'yı sağlamak için 0.01 molar PBS'de% 68 TDE'de. Dış kuvars kuvetin yaklaşık% 80'ini kırılma indisi ortamı ile nazikçe doldurun.
İç kuvars kuvetini aynı kırılma indisi ortamıyla doldurun. Numuneyi iç quvet içine batırın. İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça quvet'in dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni quvet'in ana eksenine paralel olarak düzenleyin.
Özel fişi iç quvet'in üzerine iki vida ile dikkatlice sabitleyin. Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin. İç quvet'i harici olana batırmak için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.
638 nanometre dalga boyuna sahip uyarma ışık kaynağını açın ve üç miliwatt mertebesinde düşük güce ayarlayın. Dokunun iç plakasını aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin. HC görüntü canlı kamera yazılımını açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için kamera tetikleyicisini harici kenar tetik ışığı sayfası modunda ayarlayın.
Kamera yazılımında otomatik kaydetmeyi etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın. Numuneyi kamera sensörünün görüş alanının merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle X Y düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın. Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.
Görüntüleme seansına başlamadan önce lazer gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a yükseltin. Görüntüleme yazılımının yakalama panelindeki başlat düğmesine tıklayarak tomografi alımını başlatın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi saniyede altı mikrometre sabit hızda Z ekseni boyunca hareket ettirmeye başlayın. Netlik metodolojisinin TDE ile kırılma indisi ortamı olarak kombinasyonu, numunenin nihai hacmini önemli ölçüde değiştirmez veya numunenin izotropik deformasyonuna yol açmaz.
Uyarma optikleri, görüş alanının kenarında 175 mikrometreye kadar ayrılan yaklaşık altı mikrometrelik minimum atık içeren bir ışık tabakası üretti. Kamera yuvarlanan deklanşörün ışık tabakası atıklarının eksenel taraması ile senkronizasyonu, emisyon sinyalinin yalnızca ışık tabakasının israfıyla uyarılan numune kısmında toplanmasını sağladı ve tüm görüş alanı boyunca yaklaşık 6.7 mikrometrelik ortalama F W H M ile sonuçlandı. Mikroskobun Z noktası yayılma fonksiyonu da floresan nanosferin tomografik bir rekonstrüksiyonu ile tahmin edildi ve 6.4 mikrometrelik bir F W H M fit tarafından tahmin edildi.
Sistemin tek hücre zarlarını üç boyutta, tüm organda yeterli sinyal-gürültü oranıyla çözme potansiyeli de doğrulandı. Gazdan arındırma prosedürü, protokolün en kritik adımıdır. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilmezse, doku bir temizleme çözeltisinde inkübasyon sırasında belirtilen hasarlarla karşılaşabilir.
Sunulan protokol, farklı biyolojik yapıları entegre eden bütün bir organ rekonstrüksiyonunu elde etmek için çoklu boyama protokolü ile birleştirilebilir ve patolojik modelleri incelemek için uygulanabilir.
