Protokolümüz Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri için basitleştirilmiş bir iş akışı sağlar. Sistemimiz bu model olmayan organizmadan metabolik enzimleri ve yolları kullanıyor. Başlıca avantajları, yüksek GC içeriğine sahip genlerin heterolog ifadesi, uygun bir protein iletme ortamının sağlanması ve biyosintetik yolların ince ayar için açık bir sistemdir.
Yöntemimiz Streptomices ve ilgili yüksek GC bakterilerini incelemek için yeni fırsatlar açacaktır. Bu bakterilerdeki enzimlerin ve gen ekspresyonlarının incelenmesini sağlar. Bu teknik, yeni kullanıcılar tarafından uygulama kolaylığı için geliştirilmiştir.
Önceden deneyim veya aşinalık gerektiren tek adım, son derece aktif ham özler üretmek için sonication'dır. Önceden kültürlenmiş hücreleri üçüncü günde toplamaya başlamak için, geceleme kültürünü 600 nanometrede optik yoğunluk veya OD ölçümü için taze bir GYN ortamı ile bire 10 oranında seyreltin. 600 nanometredeki kültürün OD'si 0,3'ten azsa, sarsıntı hızını dakikada 250 ila 300 döndürmeye çıkarın ve bir OD 0,3'e ulaşana kadar büyüyün.
İki saatten fazla büyümeyin. OD 0,3'ten büyükse, kültürleri santrifüj kaplarına aktarın ve ıslak buzda 30 dakika boyunca hızla soğutun. Hücre kültürünün soğumasını beklerken, dört mililitre taze bir molar dithiothreitol, S30A ve S30B tamponları hazırlayın ve buzda tutun.
Boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü tarttıktan sonra, eksi 20 santigrat derecede önceden soğutun. Buz üzerinde bir litre S30A tampona iki mililitre bir azı dişi dithiothreitol ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri 6.000 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.
Süpernatantı hızlı bir hareketle attıktan sonra, 250 mililitre S30A tamponu ekleyin ve hücre kümeleri homojen bir şekilde dağılana kadar santrifüj şişelerini kuvvetlice sallayarak hücreleri yeniden biriktirin. Sonra hücreleri altı dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve S30A tamponunun eklenmesini ve ardından gösterildiği gibi santrifüjlenmeyi tekrarlayın.
Ardından, buz üzerinde bir litre S30B tampona iki mililitre bir molar DTT ekleyin ve iyice karıştırın. Hücrelere 250 mililitre S30B tampon ekleyin ve santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın. Hücre peletini 10 mililitre S30B tampona yeniden aktarın ve hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın.
Gerekirse, artık hücreleri beş ila 10 mililitre S30B tampon ile aktarın ve tüpü S30B ile 50 mililitre hacme doldurun. Hücreleri 10 dakika santrifüjleyin. Üstnatantı atın ve santrifüjü önceki ayarlarda gösterildiği gibi tekrarlayın.
Süpernatantı attıktan sonra, kalan S30B süpernatantı 100 ila 200 mikroliter pipetle aspire edin ve ıslak hücre peletini tartın. Her bir gram ıslak hücre için 0,9 mililitre S30B tampon ekleyin. Pasteur pipet veya girdap kullanarak hücreleri yeniden depolar.
Hücreleri yatıştırmak için 500 G'ye kadar yaklaşık 10 saniye boyunca kısa bir süre santrifüjlayın. Uç sıvı yüzeyin yaklaşık bir santimetre altına gelene kadar sonicator ucunu hücre süspansiyonuna üfleyin. Sonicator ayarlarına farklı parametreler girin.
Frekansı 20 kilohertz'e, genliği %65 darbeye ve kapalı zamanı 10 saniyeye ve toplam sonikasyon süresini bir dakikaya ayarlayın. Sonication başlayın ve hücrelerin eşit sonicated emin olmak için ilk iki dinlenme döngüsü sırasında tüpü yukarı veya aşağı ve yan hareket ettirin. Hücreler tam olarak lizlenmiş değilse, tüpü iki ila üç kez ters çevirin ve hücreler tamamen bozulana kadar sık karıştırma ile bir veya iki 10 saniyelik ek döngüler için sonication'ı tekrarlayın.
Hücre kalıntılarını gidermek için lislenmiş hücreleri santrifüj edin, ardından süpernatantı bir mililitre aliquot olarak 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre özlerinin ikinci dereceden reaksiyonları için, hücre ekstresini içeren hücreyi 30 santigrat derecede bir ısı bloğunda veya bir çalkalayıcı olmadan inkübatörde 60 dakika kuluçkaya bırakın. Transkripsiyon-çeviri reaksiyon için, hücre özü SMM veya MES çözeltisini çözün ve DNA'yı buz üzerinde plazmid.
Eksi 20 santigrat derecede 384 kuyu plakasının soğutulduğu ön soğutma. Hacmin %25'inin plazmid DNA, %33,33'ünün hücre özü ve %41,67'sinin SMM çözümü olduğu buzda transkripsiyon-çeviri reaksiyonunu ayarlayın. Köpürmeyi veya kabarcık oluşumunu önlerken çözeltinin homojen olmasını sağlamak için karışımı düşük hızlı bir ayarda yaklaşık beş saniye boyunca hafifçe girdaplayın.
10 mikrolitrelik üç aliquot'u, hava kabarcıkları tanıtmadan teknik bir triplicate olarak 384 kuyu plakasının üç kuyusuna aktarın. Plakayı şeffaf bir kapakla kapattıktan sonra, plakayı beş saniye boyunca 400 kez G'de döndürün ve reaksiyonun 28 santigrat derecede bir inkübatörde veya bir plaka okuyucusunda titremeden kuluçkaya yatırın. Streptomices venezuelae hücresiz transkripsiyon-çevirisi, pTU1-A-SP44 standart plazmidinden floresan proteinlerin yanı sıra jel elektroforezi ile tespit edilen biyosentetik enzimlerin yüksek verimli ekspresyonu için optimize edilmiştir.
pTU1-A-SP44-mScarlet-I standart plazmidinin ekspresy ifadesi çeşitli yöntemler kullanılarak ölçüldü. dBroccoli RNA aptamer kullanılarak mRNA'nın gerçek zamanlı floresan ölçümleri, FlAsH etiket sistemi kullanılarak olgunlaşmamış mScarlet-I proteini ve olgun mScarlet-I proteini kullanılarak gerçekleştirildi. FlAsH etiketi kullanılarak mScarlet-I'nin jel floresan boyanması, toplam hücresiz proteinin Coomassie Blue lekelemesine ek olarak gerçekleştirildi.
Bu işlemi takiben, standart yöntemler kullanılarak zorlu olan enzimleri ve yolları incelemek için aktivite tahlilleri yapılabilir. Ayrıca ölçeklenmiş biyosentez ve yüksek verim gen ekspresyona doğru uzanır. Bu tekniği, yüksek GC bakterilerinden metabolik enzimleri incelemek için geliştiriyoruz.
Sistemimizin hücresiz reaksiyonlarda ölçeklenmiş biyosentezi inceleme potansiyelini gösterdik.
