Bu, ince bağırsağın farklı fiziksel özelliklere sahip materyalleri nasıl işlediğini ve bu malzemeleri uzayda nasıl dağıttığını inceleyen bir protokoldür. Bağırsak mekanosensitivitesi çalışmamızda tamamlayıcı bir araçtır. Bu protokolün temel avantajları, farklı fiziksel özelliklere sahip materyalleri veya karışımları incelemek için kullanılabilmesi ve çözünürlüğün kısa bağırsak segmentleri üzerinden bölgesel geçişleri çözmemize izin vermesidir.
Bu teknik, bağırsak mekanosensitivitesini anlamamıza katkıda bulunur. İnce bağırsağın intraluminal içeriklerden aldığı mekanik ipuçlarına dayanarak transit kararları nasıl verdiğini anlamamıza yardımcı olur. Başlamak için, 1 mililitrelik bir şırıngaya 18 gauge kalınlığında ve 50 milimetre uzunluğunda bir besleme tüpü takarak ve 200 mikrolitre RITC çözeltisi veya mikrosfer çözeltisi çekerek gavajı hazırlayın.
Daha sonra, tek elle kısıtlama tekniğini kullanarak oruç tutan hayvanı manuel olarak kısıtlayın, ardından besleme tüpünü mideye girene kadar farenin ağzından ve yemek borusundan yavaşça yerleştirin. Yerleştirildikten sonra, şırınga içeriğini yavaşça mideye atın ve tüpü fareden dikkatlice çıkarın. Gavage'ı takiben, fareyi kafese geri getirin.
Diseksiyonlara başlamadan önce, in vivo görüntüleme cihazını açın, böylece istenen sıcaklığa ulaşır. Ötanaziden sonra, fareyi diseksiyon aşamasında sırtüstü pozisyona yerleştirin ve karnına erişmek için dört uzantısını sahneye sabitleyin. Daha sonra, karın yüzeyini% 70 etanol ile ıslatın.
Daha sonra, cildi çekmek için mikro diseksiyon forseps kullanın ve anüsün 1 santimetre üzerinde keskin cerrahi makas kullanarak enine bir kesi yapın. İntraperitoneal boşluğu açığa çıkarmak için, insizyonu göğüs kafesine kadar karın boyunca dikey olarak devam ettirin. Bağırsakları nazikçe tutun ve manipüle etmeden önce karın boşluğundaki yönelimlerini takdir edin.
Proksimal gastroözofageal bileşke kesin, böylece mideyi yemek borusundan ayırın ve yavaşça ters yönde çekerek kolon, çekum ve ince bağırsağı yavaşça çözün. Mezenterin bağırsaklara olan bağlantılarını ayırmak için mikro diseksiyon makası kullanın. Daha sonra, forsepsleri kullanarak, disseke edilmiş bağırsakları ölçüm sayfasına aktarın.
Mideyi 0 milimetreye yerleştirin ve bağırsakları cetvel boyunca 200 milimetreye kadar düzenleyin, ardından bağırsağı mikro diseksiyon makası ile 200 milimetrede kesin ve bu bağırsak hizalama prosedürünü tekrarlayın. Doku cetvel üzerinde düzenlendikten sonra, çekumu dokuya paralel olarak düzenleyin, ancak onunla doğrudan temas halinde değil. Ölçüm sayfasını disseke edilmiş doku ile karanlık bir alana yerleştirin, böylece floresan görüntü zamanı gelene kadar korunabilir.
Ex vivo görüntülemeyi başlatmak için görüntüleme yazılımını açın. Oturum açın ve görüntü almaya hazır olmak için görüntüleme aracını başlatın. RITC gavage için, Uyarımı 535 nanometre ve Emisyonlar, 600 nanometre olarak ayarlayın.
Yeşil mikrosfer boncuklar için, Uyarılmayı 465 nanometreye ve Emisyonu 520 nanometreye ayarlayın. Şimdi, pozlamayı Otomatik olarak ayarlayın ve görüş alanını seçin. Taşıma sırasında bağırsakların kaymadığından emin olduktan sonra, ölçüm sayfasını görüş alanı içindeki cihaza yerleştirin.
Cihazın kapısını güvenli bir şekilde kapatın ve görüş alanını fotoğraflamak için Anlık Görüntü'yü seçin. Toplanan resimleri analiz için bir flash sürücüye kaydedin. Ardından, floresan ve fotoğraf görüntülerinin ayrı ayrı çekimlerini kaydedin.
Fotoğraf ve floresanın bir bindirmesi, floresan malzemelerin gastrointestinal sistemdeki yerini gösterir. Floresan ve fotoğraf görüntü dosyalarını analiz için resim düzenleme yazılımında açın. Her iki görüntünün piksel boyutunu tam boyutlara sahip olacak şekilde ayarlayın ve fotoğraf dosyasını kapatın.
Floresan görüntü için, arka planı kaldırmak ve saydam hale getirmek için bir silgi aracı kullanın. Yeni bir katman oluşturun. Katmana siyah bir dolgu seçin ve katmanı floresan görüntüyle katmanın altına uzanacak şekilde sürükleyin ve tamamen siyah bir arka plan oluşturun.
Siyah bir arka plan üzerinde yalnızca floresan sinyalini içeren yeni floresan görüntüsünü yeni bir TIF dosyası olarak kaydedin. Yeni floresan ve fotoğraf görüntülerini ImageJ'de açın. Görüntü'yü, ardından Tür ve 30 bit'i seçerek her görüntüyü 30 bit görüntüye dönüştürün.
Görüntü'yü ve ardından Renk ve Kanalları Birleştir'i seçerek her ikisinin de birleştirilmiş bir görüntüsünü oluşturun. Açılan iletişim kutusunda, gri kanal için fotoğraf dosyasını ve herhangi bir renkli kanalın altındaki floresan dosyayı seçin. Birleştirilen görüntünün ölçeğini Analiz Et'i, ardından Ölçeği Ayarla'yı ve Ölçeği Kaldırmak için Tıklat'ı seçerek kapatın.
ImageJ'de Dikdörtgen aracını seçin. İnce bağırsağın bir bölümünün etrafına bir dikdörtgen çizerken, bu ilgi alanının genişliğine çok dikkat edin, çünkü tüm ilgi bölgeleri arasında sabit kalması gerekir. Görüntü'yü, ardından Çoğalt'ı seçerek ilgilenilen bölgeyi çoğaltın ve yalnızca renkli kanala karşılık gelen kanalı seçin.
Yine, tamamen yeni görüntünün üzerine ilgi çekici bir bölge çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın ve Analiz Et'i ve ardından Grafik Profili'ni seçerek bir floresan profili alın. Değerler listesini açın ve bunları e-tablo yazılımına kopyalayın. İlgilenilen bölgenin çizilmesinden, daha önce farklı bir cetvel satırında açıklandığı gibi ince bağırsağın her bölümü için bir floresan profili almaya kadar olan adımları tekrarlayın.
Elektronik tablo yazılımında, her ortalama yoğunluk değerini, ilgili bölge dikdörtgeninin önceki adımda oluşturulan sabit genişliğiyle çarpın. Bu, her noktada ince bağırsak boyunca gerçek yoğunluk değerini verecektir. Burada ince bağırsağın uzunluğu boyunca ortalama floresan izleri gösterilmektedir.
Floresan malzemenin dağılımı, intraluminal içeriklerin malzeme özelliklerine göre değişir. Aynı ham veri kümelerini sıralamak için kullanılan kutu sayısını artırmak, daha az kutuyla çözülemeyen ayrıntılı izleme özelliklerini ortaya çıkarır. Daha küçük kutular ölçüm belirsizliğini azaltır, uzamsal çözünürlüğü arttırır ve ince bağırsak hareketliliğinin dağıtıcı bileşenini daha iyi yansıtır.
Geometrik merkez, intraluminal içeriklerin mekansal dağılımını tamamen karakterize edemez. Geometrik merkez ölçümünün bu sınırlaması, sıvılar ve daha büyük boncuklar arasındaki karşılaştırmada belirgindir. Daha büyük boncukların floresan izi daha fazla dağılmıştır, ancak yalnızca geometrik merkeze odaklanmanın sınırlamasını vurgulayan bağlama granülerliğinden bağımsız olarak, sıvınınkine benzer bir noktaya kadar ortalamasını alır.
İnce bağırsak kasılmalarının dağıtıcı doğasını açıklamak için, bu çalışmaya bir güç spektral analizi dahil edilmiştir. Güç spektrumunu çizmek, kutu boyutları küçüldükçe, daha büyük boncuk spektrumunda önemli ölçüde baskın frekanslar gözlemleyebileceğimizi, ancak küçük boncuklarınkinde gözlemleyemeyeceğimizi göstermektedir. Bu ek baskın frekansların bazıları, ancak hepsi değil, sıvı spektrumunda bulunur.
Bu protokolün en hassas adımları gavage ve diseksiyondur. Bunlar, deneysel amaçlar için bu tekniği uygulamadan önce deneyciler tarafından standartlaştırılmalıdır. Bu ölümcül bir deneydir, çünkü hayvanın kurban edilmesi gerekir.
Mümkün olduğunda, bundan önce terminal olmayan diğer deneyler yaparak hayvan modelinizin kullanımını en üst düzeye çıkarın. Grubumuz son zamanlarda bu tekniği, bağırsakların parmaklarımızın yaptığı gibi daha ince fiziksel özellikleri algılamak için epitelyal mekanoreseptörleri kullandığı bağırsak dokunma setlerini bulmamızı desteklemek için kullandı.
