Este es un protocolo que estudia cómo el intestino delgado maneja materiales de diferentes propiedades físicas y cómo distribuye esos materiales en el espacio. Es una herramienta complementaria en nuestro estudio de la mecanosensibilidad intestinal. Las principales ventajas de este protocolo son que se puede utilizar para estudiar materiales o mezclas con diferentes propiedades físicas y que la resolución nos permite resolver tránsitos regionales sobre segmentos intestinales cortos.
Esta técnica se suma a nuestra comprensión de la mecanosensibilidad intestinal. Nos ayuda a entender cómo el intestino delgado toma decisiones de tránsito basadas en las señales mecánicas que recibe del contenido intraluminal. Para comenzar, prepare el sonda nasogástrica conectando un tubo de alimentación de calibre 18 de espesor y 50 milímetros de longitud a una jeringa de 1 mililitro y extrayendo 200 microlitros de solución RITC o solución de microesfera.
Luego, sujete manualmente al animal en ayunas usando la técnica de restricción con una sola mano, luego inserte suavemente el tubo de alimentación a través de la boca y el esófago del ratón hasta que ingrese al estómago. Una vez insertado, expulse lentamente el contenido de la jeringa hacia el estómago y retire con cuidado el tubo del ratón. Siguiendo el gavage, devuelve el ratón a la jaula.
Antes de comenzar las disecciones, encienda el instrumento de imágenes in vivo para que alcance la temperatura deseada. Después de la eutanasia, coloque el ratón en posición supina en una etapa de disección y fije sus cuatro apéndices en la etapa para acceder al abdomen. A continuación, humedezca la superficie del abdomen con etanol al 70%.
Luego, use pinzas de microdisección para tirar de la piel y hacer una incisión transversal con tijeras quirúrgicas afiladas de 1 centímetro por encima del ano. Para exponer la cavidad intraperitoneal, continúe la incisión verticalmente hacia arriba del abdomen hasta la caja torácica. Maneje suavemente los intestinos y aprecie su orientación en la cavidad abdominal antes de manipularlos.
Corte el proximal a la unión gastroesofágica, separando así el estómago del esófago y desenrede suavemente el colon, el ciego y el intestino delgado tirando lentamente en la dirección opuesta. Use tijeras de microdisección para separar los accesorios del mesenterio a los intestinos. Más tarde, usando los fórceps, transfiera los intestinos disecados a la hoja de medición.
Coloque el estómago a 0 milímetros y coloque los intestinos a lo largo de la regla hasta 200 milímetros, luego corte el intestino a 200 milímetros con tijeras de microdisección y repita este procedimiento de alineación intestinal. Una vez que el tejido esté dispuesto en la regla, coloque el ciego en paralelo con el tejido, pero no en contacto directo con él. Coloque la hoja de medición con el tejido diseccionado en un área oscura para que la fluorescencia se pueda preservar hasta que sea hora de obtener imágenes.
Para iniciar la creación de imágenes ex vivo, abra el software de imágenes. Inicie sesión e inicialice el instrumento de imágenes para que esté listo para la adquisición de imágenes. Para el gavage RITC, establezca Excitación en 535 nanómetros y Emisiones, 600 nanómetros.
Mientras que para las perlas de microesferas verdes, establezca Excitación en 465 nanómetros y Emisión en 520 nanómetros. Ahora, establezca la exposición en Auto y seleccione el campo de visión. Después de asegurarse de que los intestinos no se han desplazado durante el transporte, coloque la hoja de medición en el instrumento dentro del campo de visión.
Cierre de forma segura la puerta del instrumento y seleccione Instantánea para fotografiar el campo de visión. Guarde las imágenes recopiladas en una unidad flash para su análisis. A continuación, guarde las capturas individuales de las imágenes fluorescentes y fotográficas.
Una superposición de la fotografía y la fluorescencia indica la ubicación de los materiales fluorescentes en el tracto gastrointestinal. Abra los archivos de imagen fluorescente y fotográfica en el software de edición de imágenes para su análisis. Ajuste el tamaño de píxel de ambas imágenes para tener las dimensiones exactas y cierre el archivo de fotografía.
Para la imagen fluorescente, utilice una herramienta de borrador para eliminar el fondo y hacerlo transparente. Cree una nueva capa. Elija un relleno negro en la capa y arrastre la capa para que quede debajo de la capa con la imagen fluorescente y haga un fondo completamente negro.
Guarde la nueva imagen fluorescente que contiene solo la señal fluorescente sobre un fondo negro como un nuevo archivo TIF. Abra las nuevas imágenes fluorescentes y fotográficas en ImageJ. Convierta cada imagen en una imagen de 30 bits eligiendo Imagen, seguido de Tipo y 30 bits.
Cree una imagen combinada de ambos eligiendo Imagen, seguido de Color y Combinar canales. En el cuadro de diálogo que se abre, seleccione el archivo de fotografía para el canal gris y el archivo fluorescente debajo de cualquier canal de color. Desactive la escala de la imagen combinada seleccionando Analizar, seguido de Definir escala y Haga clic para quitar escala.
Seleccione la herramienta Rectángulo en ImageJ. Dibuje un rectángulo alrededor de una sección del intestino delgado prestando mucha atención al ancho de esta región de interés, ya que debe permanecer constante entre todas las regiones de interés. Duplique la región de interés seleccionando Imagen, seguido de Duplicar y seleccione solo el canal correspondiente al canal coloreado.
De nuevo, utilice la herramienta Rectángulo para dibujar una región de interés sobre toda la nueva imagen y recuperar un perfil de fluorescencia seleccionando Analizar, seguido de Trazar perfil. Abra la lista de valores y cópielos en un software de hoja de cálculo. Repita los pasos desde el dibujo de la región de interés hasta la recuperación de un perfil de fluorescencia para cada sección del intestino delgado como se describió anteriormente en una fila de regla diferente.
En el software de hoja de cálculo, multiplique cada valor de intensidad promedio por el ancho constante del rectángulo de región de interés creado en el paso anterior. Esto producirá el valor de intensidad real a lo largo del intestino delgado en cada punto. Aquí se muestran los rastros de fluorescencia promedio a lo largo del intestino delgado.
La distribución del material fluorescente varía según las propiedades del material del contenido intraluminal. El aumento del número de contenedores utilizados para ordenar los mismos conjuntos de datos sin procesar revela características de rastreo granular irresolubles con menos contenedores. Los contenedores más pequeños disminuyen la incertidumbre de medición, aumentan la resolución espacial y reflejan mejor el componente distributivo de la motilidad del intestino delgado.
El centro geométrico no caracteriza completamente la distribución espacial de los contenidos intraluminales. Esta limitación de la medición del centro geométrico es evidente en la comparación entre líquidos y perlas más grandes. El rastro fluorescente de las cuentas más grandes está más distribuido, pero promedia hasta un punto similar al del líquido, independientemente de la granularidad de agrupación, lo que resalta la limitación de centrarse únicamente en el centro geométrico.
Para tener en cuenta la naturaleza distributiva de las contracciones del intestino delgado, se incorporó un análisis espectral de potencia en el presente estudio. Trazar el espectro de potencia demuestra que a medida que los tamaños de los contenedores se reducen, podemos observar frecuencias significativamente dominantes en el espectro de cuentas más grandes, pero no en el de las cuentas pequeñas. Algunas, pero no todas, de esas frecuencias dominantes adicionales están presentes en el espectro líquido.
Los pasos más delicados de este protocolo son el sonda y la disección. Estos deben ser estandarizados por los experimentadores antes de realizar esta técnica con fines experimentales. Este es un experimento terminal, ya que el animal necesita ser sacrificado.
Cuando sea posible, maximice el uso de su modelo animal realizando otros experimentos no terminales antes de este. Nuestro grupo ha utilizado recientemente esta técnica para apoyar nuestro hallazgo de conjuntos de contacto intestinal donde el intestino utiliza mecanorreceptores epiteliales para detectar propiedades físicas más finas, al igual que lo hacen nuestros dedos.
