이것은 소장이 다양한 물리적 특성의 물질을 처리하는 방법과 이러한 물질을 우주에 분배하는 방법을 연구하는 프로토콜입니다. 그것은 장 기계 감각에 대한 우리의 연구에서 보완적인 도구입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 물리적 특성이 다른 재료 또는 혼합물을 연구하는 데 사용할 수 있으며 해상도를 통해 짧은 장 세그먼트에 대한 지역 통과를 해결할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 장 기계 감각에 대한 우리의 이해를 더합니다. 그것은 소장이 관강 내 내용물로부터받는 기계적 신호를 기반으로 통과 결정을 내리는 방법을 이해하는 데 도움이됩니다. 시작하려면 18 밀리리터 주사기에 18 게이지 두께와 50mm 길이의 공급 튜브를 부착하고 200 마이크로 리터의 RITC 용액 또는 마이크로 스피어 용액을 채취하여 위관을 준비하십시오.
다음으로, 한 손 구속 기술을 사용하여 금식 된 동물을 수동으로 제지 한 다음 마우스의 입과 식도를 통해 공급 튜브를 위장에 들어갈 때까지 부드럽게 삽입하십시오. 삽입되면 주사기 내용물을 천천히 위장으로 배출하고 마우스에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 위관영양 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.
해부를 시작하기 전에 생체 내 이미징 기기를 켜서 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 안락사 후 마우스를 해부 단계의 앙와위 자세에 놓고 4 개의 부속기를 무대에 고정하여 복부에 접근합니다. 다음으로 복부 표면을 70 % 에탄올로 적시십시오.
다음으로, 미세 해부 집게를 사용하여 피부를 당기고 항문 위 1cm의 날카로운 수술 가위를 사용하여 가로 절개를하십시오. 복강 내 구멍을 노출하려면 흉곽까지 복부 위로 수직으로 절개를 계속하십시오. 창자를 부드럽게 다루고 조작하기 전에 복강 내 방향을 감상하십시오.
위식도 접합부 근위를 절단하여 위와 식도를 분리하고 반대 방향으로 천천히 당겨 결장, 맹장, 소장을 부드럽게 풀어줍니다. 미세 해부 가위를 사용하여 장간막의 부착물을 장에 분리하십시오. 나중에 집게를 사용하여 해부 된 장을 측정 시트로 옮깁니다.
위를 0 밀리미터에 놓고 통치자를 따라 장을 200 밀리미터까지 배열 한 다음 미세 해부 가위로 장을 200 밀리미터로 자르고 장 정렬 절차를 반복하십시오. 조직이 통치자에 배열되면 맹장을 조직과 평행하게 배열하되 직접 접촉하지 마십시오. 해부된 조직이 있는 측정 시트를 어두운 영역에 놓아 이미징할 때까지 형광을 보존할 수 있도록 합니다.
생체 외 이미징을 시작하려면 이미징 소프트웨어를 엽니다. 로그인하고 이미징 기기를 초기화하여 이미지 획득 준비를 하십시오. RITC 위관영양의 경우 여기는 535나노미터, 방출은 600나노미터로 설정합니다.
녹색 마이크로스피어 비드의 경우 여기를 465나노미터로, 방출을 520나노미터로 설정합니다. 이제 노출을 자동으로 설정하고 시야를 선택하십시오. 운송 중에 내장이 움직이지 않았는지 확인한 후 측정 시트를 시야 내의 기기에 놓습니다.
측량기 도어를 단단히 닫고 스냅샷을 선택하여 시야를 촬영합니다. 분석을 위해 수집한 사진을 플래시 드라이브에 저장합니다. 다음으로, 형광등 및 사진 이미지의 개별 캡처를 저장합니다.
사진과 형광의 오버레이는 위장관에서 형광 물질의 위치를 나타냅니다. 분석을 위해 사진 편집 소프트웨어에서 형광등 및 사진 이미지 파일을 엽니다. 정확한 치수를 갖도록 두 이미지의 픽셀 크기를 조정하고 사진 파일을 닫습니다.
형광 이미지의 경우 지우개 도구를 사용하여 배경을 제거하고 투명하게 만듭니다. 새 레이어를 만듭니다. 레이어에 검은색 채우기를 선택하고 레이어를 드래그하여 형광 이미지가 있는 레이어 아래에 놓고 완전히 검은색 배경을 만듭니다.
검은색 배경에 형광 신호만 포함된 새 형광 이미지를 새 TIF 파일로 저장합니다. ImageJ에서 새 형광등 및 사진 이미지를 엽니다. 이미지를 선택한 다음 유형 및 30비트를 선택하여 각 이미지를 30비트 이미지로 변환합니다.
이미지를 선택한 다음 색상 및 병합 채널을 선택하여 둘 다의 병합된 이미지를 만듭니다. 대화 상자가 열리면 회색 채널에 대한 사진 파일과 형광 파일 색상 채널 아래를 선택합니다. 분석을 선택하여 병합된 이미지의 비율을 끄고 그 다음에 배율 설정 및 클릭하여 배율 제거를 선택합니다.
ImageJ에서 사각형 도구를 선택합니다. 모든 관심 영역 간에 일정하게 유지되어야 하므로 이 관심 영역의 너비에 세심한 주의를 기울이면서 소장의 한 부분 주위에 직사각형을 그립니다. 이미지를 선택한 다음 복제를 선택하여 관심 영역을 복제하고 컬러 채널에 해당하는 채널만 선택합니다.
다시 사각형 도구를 사용하여 전체 새 이미지에 관심 영역을 그리고 분석을 선택한 다음 플롯 프로파일을 선택하여 형광 프로파일을 검색합니다. 값 목록을 열고 스프레드시트 소프트웨어에 복사합니다. 관심 영역 그리기에서 다른 눈금자 행에서 이전에 설명한 대로 소장의 각 섹션에 대한 형광 프로파일 검색까지 단계를 반복합니다.
스프레드시트 소프트웨어에서 각 평균 강도 값에 이전 단계에서 만든 관심 영역 사각형의 일정한 너비를 곱합니다. 이렇게 하면 각 지점에서 소장을 따라 실제 강도 값이 생성됩니다. 여기에 표시된 것은 소장의 길이에 따른 평균 형광 흔적입니다.
형광 물질의 분포는 관강 내 내용물의 물질 특성에 따라 달라진다. 동일한 원시 데이터 세트를 정렬하는 데 사용되는 구간차원 수를 늘리면 더 적은 수의 구간차원으로 해결할 수 없는 세분화된 추적 기능이 드러납니다. 더 작은 빈은 측정 불확실성을 줄이고 공간 분해능을 높이며 소장 운동성의 분배 구성 요소를 더 잘 반영합니다.
기하학적 중심은 강내 내용물의 공간적 분포를 완전히 특성화하지 못합니다. 기하학적 중심 측정의 이러한 한계는 액체와 더 큰 비드의 비교에서 분명합니다. 더 큰 비드의 형광 흔적은 더 많이 분포되어 있지만 비닝 입도에 관계없이 액체의 평균과 유사한 지점까지 평균화되어 기하학적 중심에만 초점을 맞추는 한계를 강조합니다.
소장 수축의 분배 특성을 설명하기 위해, 파워 스펙트럼 분석이 본 연구에 통합되었다. 전력 스펙트럼을 플로팅하면 빈 크기가 줄어들면 더 큰 비드 스펙트럼에서는 상당히 우세한 주파수를 관찰할 수 있지만 작은 비드에서는 관찰할 수 없음을 알 수 있습니다. 전부는 아니지만 이러한 추가 우성 주파수 중 일부가 액체 스펙트럼에 존재합니다.
이 프로토콜의 가장 섬세한 단계는 위관과 해부입니다. 실험 목적으로이 기술을 수행하기 전에 실험자가 표준화해야합니다. 이것은 동물을 희생해야하기 때문에 말기 실험입니다.
가능하면 이 실험 전에 다른 비터미널 실험을 수행하여 동물 모델의 사용을 최대화합니다. 우리 그룹은 최근이 기술을 사용하여 장이 상피 기계 수용체를 사용하여 손가락처럼 미세한 물리적 특성을 감지하는 내장 터치 세트의 발견을 지원했습니다.
