هذا بروتوكول يدرس كيفية تعامل الأمعاء الدقيقة مع المواد ذات الخصائص الفيزيائية المختلفة وكيفية توزيعها لتلك المواد في الفضاء. إنها أداة تكميلية في دراستنا للحساسية الميكانيكية للأمعاء. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكن استخدامه لدراسة المواد أو المخاليط ذات الخصائص الفيزيائية المختلفة وأن القرار يسمح لنا بحل العبور الإقليمي عبر أجزاء معوية قصيرة.
تضيف هذه التقنية إلى فهمنا لحساسية الأمعاء الميكانيكية. يساعدنا على فهم كيفية اتخاذ الأمعاء الدقيقة قرارات العبور بناء على الإشارات الميكانيكية التي تتلقاها من المحتويات داخل اللمعان. للبدء ، قم بإعداد gavage عن طريق توصيل أنبوب تغذية بسماكة 18 مقياسا وطول 50 ملم بحقنة 1 ملليلتر ورسم 200 ميكرولتر من محلول RITC أو محلول microsphere.
بعد ذلك ، قم بتقييد الحيوان الصائم يدويا باستخدام تقنية تقييد اليد الواحدة ، ثم أدخل أنبوب التغذية بلطف عبر الفم والمريء للفأر حتى يدخل المعدة. بمجرد إدخالها ، اطرد محتويات المحقنة ببطء إلى المعدة وقم بإزالة الأنبوب بعناية من الماوس. بعد gavage ، أعد الماوس إلى القفص.
قبل البدء في التشريح ، قم بتشغيل أداة التصوير في الجسم الحي حتى تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة. بعد القتل الرحيم ، ضع الفأر في وضع ضعيف على مرحلة تشريح وقم بتثبيت زوائده الأربعة على المسرح للوصول إلى البطن. بعد ذلك ، رطب سطح البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
بعد ذلك ، استخدم ملقط التشريح الدقيق لسحب الجلد وإجراء شق عرضي باستخدام مقص جراحي حاد 1 سم فوق فتحة الشرج. لفضح التجويف داخل الصفاق ، استمر في الشق عموديا حتى البطن حتى القفص الصدري. تعامل بلطف مع الأمعاء وقدر اتجاهها في تجويف البطن قبل التلاعب بها.
قطع القريب إلى تقاطع المعدة والمريء ، وبالتالي فصل المعدة عن المريء وكشف بلطف القولون والأعور والأمعاء الدقيقة عن طريق السحب ببطء في الاتجاه المعاكس. استخدم مقص التشريح الدقيق لفصل مرفقات المساريق بالأمعاء. في وقت لاحق ، باستخدام الملقط ، انقل الأمعاء المشوهة إلى ورقة القياس.
ضع المعدة عند 0 ملم ورتب الأمعاء على طول المسطرة حتى 200 ملم ، ثم اقطع الأمعاء عند 200 ملم بمقص تشريح دقيق وكرر هذا الإجراء لمحاذاة الأمعاء. بمجرد ترتيب الأنسجة على المسطرة ، رتب الأعور بالتوازي مع الأنسجة ، ولكن ليس على اتصال مباشر بها. ضع ورقة القياس مع الأنسجة المشوهة في منطقة مظلمة حتى يمكن الحفاظ على التألق حتى يحين وقت التصوير.
لبدء التصوير خارج الجسم الحي، افتح برنامج التصوير. قم بتسجيل الدخول وتهيئة أداة التصوير لتكون جاهزة للحصول على الصورة. بالنسبة ل RITC gavage ، اضبط الإثارة على 535 نانومتر والانبعاثات ، 600 نانومتر.
بينما بالنسبة للخرز المجهري الأخضر ، اضبط الإثارة على 465 نانومتر والانبعاثات على 520 نانومتر. الآن ، اضبط التعرض على تلقائي وحدد مجال الرؤية. بعد التأكد من أن الأمعاء لم تتحول أثناء النقل ، ضع ورقة القياس في الأداة داخل مجال الرؤية.
أغلق باب الجهاز بإحكام وحدد لقطة لتصوير مجال الرؤية. احفظ الصور التي تم جمعها على محرك أقراص محمول لتحليلها. بعد ذلك ، احفظ اللقطات الفردية للصور الفلورية والصور الفوتوغرافية.
يشير تراكب الصورة والتألق إلى موقع المواد الفلورية في الجهاز الهضمي. افتح ملفات الصور الفلورية والصور الفوتوغرافية في برنامج تحرير الصور للتحليل. اضبط حجم البكسل لكلتا الصورتين للحصول على الأبعاد الدقيقة وأغلق ملف الصورة.
بالنسبة للصورة الفلورية ، استخدم أداة ممحاة لإزالة الخلفية وجعلها شفافة. إنشاء طبقة جديدة. اختر تعبئة سوداء للطبقة واسحب الطبقة لتقع أسفل الطبقة مع صورة الفلورسنت وقم بعمل خلفية سوداء بالكامل.
احفظ صورة الفلورسنت الجديدة التي تحتوي فقط على إشارة الفلورسنت على خلفية سوداء كملف TIF جديد. افتح صور الفلورسنت والصور الفوتوغرافية الجديدة في ImageJ. حول كل صورة إلى صورة 30 بت عن طريق اختيار صورة، متبوعة بالنوع و30 بت.
قم بإنشاء صورة مدمجة لكليهما عن طريق اختيار صورة، متبوعة بقنوات اللون والدمج. في مربع الحوار الذي يفتح، حدد ملف الصورة الفوتوغرافية للقناة الرمادية وملف الفلورسنت ضمن أي قنوات ملونة. قم بإيقاف تشغيل مقياس الصورة المدمجة عن طريق تحديد تحليل، متبوعا بتعيين مقياس وانقر لإزالة المقياس.
حدد أداة المستطيل في ImageJ. ارسم مستطيلا حول جزء من الأمعاء الدقيقة مع إيلاء اهتمام وثيق لعرض هذه المنطقة ذات الاهتمام ، حيث يجب أن تظل ثابتة بين جميع المناطق ذات الاهتمام. قم بتكرار المنطقة ذات الأهمية عن طريق تحديد صورة، متبوعة ب Duplicate وحدد القناة المقابلة للقناة الملونة فقط.
مرة أخرى ، استخدم أداة المستطيل لرسم منطقة ذات أهمية على الصورة الجديدة بالكامل واسترداد ملف تعريف التألق عن طريق تحديد تحليل ، متبوعا بملف تعريف Plot. افتح قائمة القيم وانسخها إلى برنامج جداول البيانات. كرر الخطوات من رسم المنطقة ذات الأهمية إلى استرداد ملف تعريف التألق لكل قسم من الأمعاء الدقيقة كما هو موضح سابقا على صف مسطرة مختلف.
في برنامج جداول البيانات، اضرب كل متوسط قيمة كثافة في العرض الثابت لمستطيل المنطقة محل الاهتمام الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. هذا سوف يؤدي إلى قيمة الكثافة الحقيقية على طول الأمعاء الدقيقة في كل نقطة. يظهر هنا متوسط آثار التألق على طول الأمعاء الصغيرة.
يختلف توزيع المواد الفلورية وفقا لخصائص المواد للمحتويات داخل اللمعان. تكشف زيادة عدد الصناديق المستخدمة لفرز نفس مجموعات البيانات الخام عن ميزات تتبع دقيقة غير قابلة للحل مع عدد أقل من المهملات. تقلل الصناديق الأصغر حجما من عدم اليقين في القياس ، وتزيد من الدقة المكانية ، وتعكس بشكل أفضل المكون التوزيعي لحركية الأمعاء الدقيقة.
يفشل المركز الهندسي في توصيف التوزيع المكاني للمحتويات داخل اللمعان بشكل كامل. هذا القيد في قياس المركز الهندسي واضح في المقارنة بين السوائل والخرز الأكبر. إن أثر الفلورسنت للحبات الأكبر حجما أكثر توزيعا ، لكنه يصل في المتوسط إلى نقطة مماثلة لتلك الموجودة في السائل ، بغض النظر عن دقة التجليد ، مما يسلط الضوء على قيود التركيز فقط على المركز الهندسي.
ولتفسير الطبيعة التوزيعية لانقباضات الأمعاء الدقيقة، أدرج تحليل طيفي للطاقة في هذه الدراسة. يوضح رسم طيف الطاقة أنه مع تقلص أحجام الصناديق ، يمكننا ملاحظة الترددات المهيمنة بشكل كبير في طيف الخرز الأكبر ، ولكن ليس في طيف الخرز الصغير. بعض ، وليس كل ، من تلك الترددات المهيمنة الإضافية موجودة في الطيف السائل.
الخطوات الأكثر حساسية في هذا البروتوكول هي gavage والتشريح. يجب أن يتم توحيدها من قبل المجربين قبل تنفيذ هذه التقنية لأغراض تجريبية. هذه تجربة نهائية ، حيث يحتاج الحيوان إلى التضحية به.
عندما يكون ذلك ممكنا ، قم بتعظيم استخدام النموذج الحيواني الخاص بك عن طريق إجراء تجارب أخرى غير طرفية قبل هذا النموذج. استخدمت مجموعتنا مؤخرا هذه التقنية لدعم اكتشافنا لمجموعات لمس الأمعاء حيث تستخدم الأمعاء مستقبلات ميكانيكية ظهارية لاستشعار الخصائص الفيزيائية الدقيقة ، تماما كما تفعل أصابعنا.
