Il s’agit d’un protocole qui étudie comment l’intestin grêle traite les matériaux de différentes propriétés physiques et comment il distribue ces matériaux dans l’espace. C’est un outil complémentaire dans notre étude de la mécanosensibilité intestinale. Les principaux avantages de ce protocole sont qu’il peut être utilisé pour étudier des matériaux ou des mélanges ayant des propriétés physiques différentes et que la résolution nous permet de résoudre les transits régionaux sur des segments intestinaux courts.
Cette technique ajoute à notre compréhension de la mécanosensibilité intestinale. Il nous aide à comprendre comment l’intestin grêle prend des décisions de transit basées sur les signaux mécaniques qu’il reçoit du contenu intraluminal. Pour commencer, préparez le gavage en attachant un tube d’alimentation de 18 épaisseurs de calibre et 50 millimètres de longueur à une seringue de 1 millilitre et en prélevant 200 microlitres de solution RITC ou de solution de microsphère.
Ensuite, immobilisez manuellement l’animal à jeun à l’aide de la technique de contention à une main, puis insérez doucement la sonde d’alimentation dans la bouche et l’œsophage de la souris jusqu’à ce qu’elle pénètre dans l’estomac. Une fois inséré, expulsez lentement le contenu de la seringue dans l’estomac et retirez délicatement le tube de la souris. Après le gavage, remettez la souris dans la cage.
Avant de commencer les dissections, allumez l’instrument d’imagerie in vivo afin qu’il atteigne la température désirée. Après l’euthanasie, placez la souris en décubitus dorsal sur une scène de dissection et épinglez ses quatre appendices sur la scène pour accéder à l’abdomen. Ensuite, mouillez la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.
Ensuite, utilisez des pinces à micro-dissection pour tirer la peau et faites une incision transversale à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants à 1 centimètre au-dessus de l’anus. Pour exposer la cavité intrapéritonéale, continuez l’incision verticalement jusqu’à la cage thoracique. Manipulez délicatement les intestins et appréciez leur orientation dans la cavité abdominale avant de les manipuler.
Coupez le proximal à la jonction gastro-œsophagienne, séparant ainsi l’estomac de l’œsophage et démêlez doucement le côlon, le caecum et l’intestin grêle en tirant lentement dans la direction opposée. Utilisez des ciseaux de microdissection pour séparer les attaches du mésentère aux intestins. Plus tard, à l’aide de la pince, transférez les intestins disséqués sur la feuille de mesure.
Placez l’estomac à 0 millimètre et disposez les intestins le long de la règle jusqu’à 200 millimètres, puis coupez l’intestin à 200 millimètres avec des ciseaux à micro-dissection et répétez cette procédure d’alignement intestinal. Une fois que le tissu est disposé sur la règle, disposez le caecum parallèlement au tissu, mais pas en contact direct avec lui. Placez la feuille de mesure avec le tissu disséqué dans une zone sombre afin que la fluorescence puisse être préservée jusqu’à ce qu’il soit temps d’imager.
Pour démarrer l’imagerie ex vivo, ouvrez le logiciel d’imagerie. Connectez-vous et initialisez l’instrument d’imagerie pour être prêt pour l’acquisition d’images. Pour le gavage RITC, réglez Excitation à 535 nanomètres et Émissions, 600 nanomètres.
Alors que pour les perles de microsphère vertes, réglez Excitation à 465 nanomètres et Emission à 520 nanomètres. Maintenant, réglez l’exposition sur Auto et sélectionnez le champ de vision. Après vous être assuré que les intestins ne se sont pas déplacés pendant le transport, placez la feuille de mesure dans l’instrument dans le champ de vision.
Fermez solidement la porte de l’instrument et sélectionnez Instantané pour photographier le champ de vision. Enregistrez les images collectées sur un lecteur flash pour analyse. Ensuite, enregistrez les captures individuelles des images fluorescentes et photographiques.
Une superposition de la photographie et de la fluorescence indique l’emplacement des matériaux fluorescents dans le tractus gastro-intestinal. Ouvrez les fichiers d’images fluorescentes et photographiques dans le logiciel de retouche d’image pour analyse. Ajustez la taille en pixels des deux images pour obtenir les dimensions exactes et fermez le fichier photo.
Pour l’image fluorescente, utilisez un outil de gomme pour supprimer l’arrière-plan et le rendre transparent. Créez un calque. Choisissez un fond noir sur le calque et faites glisser le calque pour qu’il se trouve sous le calque avec l’image fluorescente et crée un arrière-plan entièrement noir.
Enregistrez la nouvelle image fluorescente contenant uniquement le signal fluorescent sur fond noir en tant que nouveau fichier TIF. Ouvrez les nouvelles images fluorescentes et photographiques dans ImageJ. Transformez chaque image en image 30 bits en choisissant Image, puis Type et 30 bits.
Créez une image fusionnée des deux en choisissant Image, puis Couleur et Fusionner les couches. Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, sélectionnez le fichier photo pour la couche grise et le fichier fluorescent Sous les couches colorées. Désactivez l’échelle de l’image fusionnée en sélectionnant Analyser, puis Définir l’échelle et Cliquez pour supprimer l’échelle.
Sélectionnez l’outil Rectangle dans ImageJ. Dessinez un rectangle autour d’une section de l’intestin grêle tout en portant une attention particulière à la largeur de cette région d’intérêt, car elle doit rester constante entre toutes les régions d’intérêt. Dupliquez la région d’intérêt en sélectionnant Image, puis Dupliquer et sélectionnez uniquement le canal correspondant au canal coloré.
Encore une fois, utilisez l’outil Rectangle pour dessiner une région d’intérêt sur l’ensemble de la nouvelle image et récupérez un profil de fluorescence en sélectionnant Analyser, puis Profil de tracé. Ouvrez la liste des valeurs et copiez-les dans un tableur. Répétez les étapes du dessin de la région d’intérêt à la récupération d’un profil de fluorescence pour chaque section de l’intestin grêle, comme décrit précédemment sur une rangée de règles différente.
Dans le tableur, multipliez chaque valeur d’intensité moyenne par la largeur constante du rectangle de région d’intérêt créée à l’étape précédente. Cela donnera la valeur d’intensité réelle le long de l’intestin grêle à chaque point. Voici les traces de fluorescence moyennes le long de l’intestin grêle.
La distribution du matériau fluorescent varie en fonction des propriétés matérielles du contenu intraluminal. L’augmentation du nombre de bacs utilisés pour trier les mêmes ensembles de données brutes révèle des caractéristiques de trace granulaire insolubles avec moins de bacs. Des bacs plus petits réduisent l’incertitude de mesure, augmentent la résolution spatiale et reflètent mieux la composante distributive de la motilité de l’intestin grêle.
Le centre géométrique ne parvient pas à caractériser complètement la distribution spatiale des contenus intraluminaux. Cette limitation de la mesure du centre géométrique est évidente dans la comparaison entre les liquides et les billes plus grandes. La trace fluorescente des plus grosses billes est plus distribuée, mais elle atteint en moyenne un point similaire à celui du liquide, indépendamment de la granularité de binning, ce qui souligne la limitation de la focalisation uniquement sur le centre géométrique.
Pour tenir compte de la nature distributive des contractions de l’intestin grêle, une analyse spectrale de puissance a été intégrée à la présente étude. Le tracé du spectre de puissance montre qu’à mesure que la taille des bacs diminue, nous pouvons observer des fréquences significativement dominantes dans le spectre des billes plus grandes, mais pas dans celui des petites perles. Certaines de ces fréquences dominantes supplémentaires, mais pas toutes, sont présentes dans le spectre liquide.
Les étapes les plus délicates de ce protocole sont le gavage et la dissection. Ceux-ci doivent être normalisés par les expérimentateurs avant d’effectuer cette technique à des fins expérimentales. Il s’agit d’une expérience terminale, car l’animal doit être sacrifié.
Dans la mesure du possible, maximisez l’utilisation de votre modèle animal en effectuant d’autres expériences non terminales avant celle-ci. Notre groupe a récemment utilisé cette technique pour soutenir notre découverte d’ensembles tactiles intestinaux où l’intestin utilise des mécanorécepteurs épithéliaux pour détecter des propriétés physiques plus fines, un peu comme le font nos doigts.
