이 프로토콜은 난모세포에서 미토콘드리아 DNA 카피 수를 상당히 감소시킨다. 그것은 종 내 복제에 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 소 난모세포의 미토콘드리아 DNA 카피 수를 90% 이상 감소시켜 복제된 배아에서 미토콘드리아 헤테로플라스마의 발생률을 감소시킬 수 있다.
내 실험실의 박사 과정 학생 인 Laura Adams는 절차를 시연 할 것입니다. 시작하려면, 피펫을 사용하여, HSOF 방울로부터 선택된 성숙 난모세포를 수집하고, 이를 HSOF CB 용액 50 마이크로리터를 함유하는 1.5 밀리리터 튜브 내로 놓는다. 난모세포를 15, 000배 G에서 12분 동안 원심분리한다.
난모세포가 원심분리되는 동안, 복절 플레이트를 준비하십시오. 이를 위해 방울 당 20 마이크로 리터를 사용하여 60 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑에 패턴을 만들고 방울을 미네랄 오일로 완전히 덮으십시오. 얇은 팁이 달린 마커를 사용하여 접시 아래에 선을 표시하십시오.
마이크로 드롭의 삼투압 변화를 방지하기 위해 원심분리가 완료 될 때까지 불투명 한 뚜껑으로 접시를 덮으십시오. 원심분리가 완료되면 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 용액 내의 난모세포를 수집하고 HSOF 방울을 통해 난모세포를 세척하기 전에 4, 400 마이크로리터 HSOF 방울이 있는 새로운 검색 플레이트의 빈 부분으로 옮깁니다. 가열 단계를 섭씨 38.5도까지 켭니다.
구강 피펫을 사용하여 원심분리된 난모세포를 HSOF 드롭으로부터 분리판의 왼쪽 T2 방울 상단으로 이동시킨다. 그런 다음 상단 줄의 다음 세 방울을 통해 난모세포를 씻으십시오. 난모세포를 프로나제 방울 중 하나에 침착시켜 이들 사이에 접촉이 거의 없거나 전혀 없음을 보장합니다.
zonae pellucidae의 명확한 변형이있을 때까지 난모세포를 관찰하십시오. 단일 난모세포 조나 펠루시다가 변형되면 그 난모세포를 이웃 T2 방울로 옮깁니다. 추가 난모세포가 변형되면 모든 난모세포가 프로나제에서 제거되어 T2 방울에 놓일 때까지 반복하십시오.
zona pellucida의 얇은 층 만 남을 때까지 난모세포를 관찰하십시오. 행 내의 다음 세 방울을 통해 난모세포를 씻은 다음 CBT20 방울 내의 수직선으로 증착하십시오. 수직선에서 더 적은 난모세포로 시작하고, 이절제 기술이 진행됨에 따라 방울 당 난모세포의 수를 증가시킨다.
난모세포가 들어있는 첫 번째, 가장 왼쪽의 CBT20 방울에 초점을 맞추고 입 피펫을 사용하여 난모세포를 회전시켜 각 난모세포의 미토콘드리아 밀도가 높은 부분이 현미경의 팔을 향하게하거나 멀리 향하게하십시오. 마이크로 블레이드의 끝을 미토콘드리아 밀도가 높은 부분 바로 위의 공간에 맞춰 맨 위 난모세포의 왼쪽에 놓습니다. 블레이드의 끝을 같은 장소에 보관하고 조심스럽게 블레이드를 내려 난모세포를 끝까지 자릅니다.
미토콘드리아-농축 ooplast와 미토콘드리아-환원된 ooplast가 대략 동일한 크기인지 확인하고, 칼날이 원심분리된 난모세포의 가장 명확한 세그먼트에서 이분되고 있는지 확인하십시오. 블레이드를 들어 올릴 때 동일한 라인이 유지되고 블레이드의 팁이 같은 위치에 있는지 확인한 다음 플레이트에서 팁을 부드럽게 들어 올립니다. 첫 번째 절제술 방울 내의 모든 난모세포에 대해 쌍절 단계를 반복하십시오.
난모세포가 추가 방울로 존재하는 경우, 나머지 난모세포를 오리엔테이션하고 이등분한다. 입 피펫을 사용하여 첫 번째 bisection 방울에서 미토콘드리아가 감소 된 ooplasts를 수집하십시오. 플레이트의 하단 행에있는 왼쪽 T20 드롭에 놓습니다.
나머지 모든 단면 드롭에 대해 반복하십시오. 입 피펫을 사용하여 첫 번째 bisection 방울에서 미토콘드리아 조밀 한 ooplasts를 수집하십시오. 플레이트의 하단 줄에있는 오른손 T20 드롭에 놓습니다.
나머지 모든 단면 드롭에 대해 반복하십시오. 인큐베이터에서 T10 네 웰 접시를 회수하십시오. 입 피펫을 사용하여 모든 미토콘드리아-환원된 ooplasts를 잘 라벨링된 MR로 옮기고, 미토콘드리아-조밀 ooplasts를 잘 라벨링된 M.Place 네 웰 플레이트를 이산화탄소 제어 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
mtDNA의 정량화 전에 ooplasts가 적어도 30 분 동안 쉬도록 허용하십시오. 성공적인 복절을 위해, 전체 난모세포와 미토콘드리아 밀도가 높은 ooplasts로부터의 샘플은 유사한 CT 값을 갖는다. 미토콘드리아-환원된 ooplasts로부터의 샘플은 다른 두 그룹의 샘플과 비교했을 때 더 높은 CT 값을 갖는다.
실패한 복절편의 경우, 양성절은 미토콘드리아-환원된 ooplasts에서 mtDNA 함량을 효과적으로 감소시키지 않는다. 표준 곡선의 생산 및 제공된 mtDNA 카피 수 공식의 사용에 따라, 93.88%의 평균 난모세포 mtDNA 감소가 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 이절제 방울에서 각 난모세포의 방향을 정확하게 정하고, 각 난모세포를 정확하게 이분하고, ooplasts를 정확하게 분류하는 것은 성공적인 결과를 얻기 위해 취해야 할 중요한 단계입니다.
두 개의 ooplasts는 하나의 체세포와 융합 될 수 있습니다. 이어서, 융합된 삼중항은 화학적으로 활성화되고 재구성된 배아로서 배양될 수 있다.
