このプロトコールは、卵母細胞におけるミトコンドリアDNAコピー数を有意に減少させる。それは種内クローニングにとって有益かもしれません。この方法は、ウシ卵母細胞におけるミトコンドリアDNAコピー数を90%以上減少させ、クローン胚におけるミトコンドリアヘテロプラスミーの発生率を低下させる可能性がある。
私の研究室の博士課程の学生であるLaura Adamsが手順を実演します。まず、ピペットを使用して、HSOF滴から選択した成熟卵母細胞を収集し、50マイクロリットルのHSOF CB溶液を含む1.5ミリリットルチューブに入れます。卵母細胞を15, 000回Gで12分間遠心分離する。
卵母細胞が遠心分離されている間に、二分割プレートを準備する。このためには、1滴あたり20マイクロリットルを使用して60ミリメートルのペトリ皿の蓋にパターンを作ることから始めて、そしてミネラルオイルで滴を完全に覆います。細い先端のマーカーを使って,皿の下の線に印を付けます。
マイクロドロップの浸透圧変化を防ぐために、遠心分離が完了するまで皿を不透明な蓋で覆います。遠心分離が完了したらすぐに、200マイクロリットルのピペットを使用して溶液中の卵母細胞を収集し、HSOF滴を通して卵母細胞を洗浄する前に、400マイクロリットルのHSOF滴を含む新しい検索プレートの空部分に移動する。加熱ステージを摂氏 38.5 度にオンにします。
マウスピペットを使用して、遠心分離した卵母細胞をHSOF滴から二分割プレートの左上のT2滴に移動する。次に、卵母細胞を一番上の行の次の3滴を通して洗い流します。卵母細胞をプロナーゼ滴の1つに沈着させ、それらの間にほとんどまたはまったく接触がないことを保証する。
透明帯の明確な変形があるまで卵母細胞を観察してください。単一の卵母細胞透明帯が変形したら、その卵母細胞を隣接するT2ドロップに移動します。追加の卵母細胞が変形するにつれて、すべての卵母細胞がプロナーゼから除去され、T2ドロップに入れられるまで繰り返す。
透明帯の薄い層だけが残るまで卵母細胞を観察します。卵母細胞を行内の次の3滴を通して洗浄し、CBT20滴内の垂直線に沈着させる。縦線の卵母細胞の数を減らすことから始め、二分法スキルが進歩するにつれて、1滴あたりの卵母細胞の数を増やします。
卵母細胞を含む最初の左端のCBT20滴に焦点を合わせ、マウスピペットを使用して卵母細胞を回転させ、各卵母細胞のミトコンドリア密度部分が顕微鏡の腕に向いているか、または遠ざかるようにします。マイクロブレードの先端を、ミトコンドリア緻密な部分の真上の空間に沿って、最上部の卵母細胞の左側に置きます。刃の先端を同じ場所に保ち、卵母細胞を最後まで切断するために慎重に刃を下げます。
ミトコンドリア密度の高い卵胞体とミトコンドリア縮小型卵胞体がほぼ同じサイズであり、遠心分離された卵母細胞の最も透明な部分でブレードが二等分されていることを確認します。ブレードを持ち上げるときは、同じラインが維持されていること、およびブレードの先端が同じ場所に残っていることを確認してから、プレートから先端を慎重に持ち上げます。最初の二分切除滴内のすべての卵母細胞について二分切開ステップを繰り返します。
卵母細胞が追加の滴で存在する場合は、残りの卵母細胞を配向させ、二等分する。口のピペットを使用して、最初の二分割滴からミトコンドリア還元型卵子を採取する。プレートの一番下の列にある左側のT20ドロップに置きます。
残りのすべての二等分滴について繰り返します。口のピペットを使用して、最初の二分割滴からミトコンドリアの高密度のオプラストを収集する。プレートの一番下の列にある右手のT20ドロップに置きます。
残りのすべての二等分滴について繰り返します。インキュベーターからT10 4ウェルディッシュを取り出します。マウスピペットを使用して、すべてのミトコンドリア還元型オプラストをウェル標識MRに移動し、ミトコンドリア密度のオプラストをウェルラベル付きM.Placeに移動させ、4ウェルプレートを二酸化炭素制御インキュベーターに戻します。
mtDNAの定量化の前に、オプラストを少なくとも30分間休ませてください。二分割を成功させるために、卵母細胞全体およびミトコンドリア密度の卵子からのサンプルは、同様のCT値を有する。ミトコンドリア還元型卵子からのサンプルは、他の2つの群からのサンプルと比較して、より高いCT値を有する。
二分割が失敗した場合、二分はミトコンドリア減少卵胞におけるmtDNA含量を効果的に減少させない。標準曲線の作成および提供されたmtDNAコピー数式の使用に続いて、このプロトコルを使用して93.88%の平均卵母細胞mtDNA減少が達成された。二分割滴中の各卵母細胞を正しく配向させ、各卵母細胞を正確に二等分し、卵胞体を正確に選別することは、すべて成功した結果を得るために取るべき重要なステップである。
2つのオープラストは、1つの体細胞と融合させることができる。融合した三重子は、化学的に活性化され、再構築された胚として培養され得る。
