El protocolo reduce significativamente el número de copias de ADN mitocondrial en el ovocito. Eso podría ser beneficioso para la clonación intraespecie. Este método reduce el número de copias de ADN mitocondrial en ovocitos bovinos en más del 90%, lo que podría reducir la incidencia de heteroplasmia mitocondrial en embriones clonados.
Laura Adams, una estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar, usando una pipeta, recoja los ovocitos maduros seleccionados de la gota HSOF y colóquelos en el tubo de 1.5 mililitros que contiene 50 microlitros de la solución HSOF CB. Centrifugar los ovocitos a 15.000 veces G durante 12 minutos.
Mientras se centrifugan los ovocitos, prepara la placa de bisección. Para esto, comience haciendo un patrón en la tapa de una placa de Petri de 60 milímetros utilizando 20 microlitros por gota, y cubra completamente las gotas con aceite mineral. Usando un marcador de punta delgada, marque las líneas debajo del plato.
Cubra el plato con una tapa opaca hasta que se complete la centrifugación para evitar cambios de osmolaridad de las microgotas. Tan pronto como se complete la centrifugación, use una pipeta de 200 microlitros para recolectar los ovocitos dentro de la solución y muévalos a una porción vacía de una nueva placa de búsqueda con cuatro gotas HSOF de 400 microlitros, antes de lavar los ovocitos a través de gotas HSOF. Encienda la etapa de calentamiento a 38.5 grados Centígrados.
Use una pipeta bucal para mover los ovocitos centrifugados de la gota HSOF a la gota T2 superior izquierda de la placa de bisección. Luego lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas en la fila superior. Deposite los ovocitos en una de las gotas de pronasa, asegurando que haya poco o ningún contacto entre ellos.
Observar los ovocitos hasta que haya una deformación clara de la zonae pellucidae. Una vez que una sola zona pelúcida de ovocitos se ha deformado, mueva ese ovocito a la vecina gota T2. Repita a medida que los ovocitos adicionales se deformen, hasta que todos los ovocitos se hayan eliminado de la pronasa y se hayan colocado en la gota T2.
Observe los ovocitos hasta que solo quede una capa delgada de la zona pelúcida. Lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas dentro de la fila, luego deposite en líneas verticales dentro de las gotas CBT20. Comience con menos ovocitos en las líneas verticales y aumente el número de ovocitos por gota a medida que progresan las habilidades de bisección.
Concéntrese en la primera gota de CBT20 más a la izquierda que contiene ovocitos, y use una pipeta bucal para rotar los ovocitos de modo que la porción densa en mitocondrias de cada ovocito esté orientada hacia o lejos del brazo del microscopio. Coloque la punta de la microcuchilla a la izquierda del ovocito superior, en línea con el espacio directamente sobre la porción densa en mitocondrias. Manteniendo la punta de la cuchilla en el mismo lugar, baje cuidadosamente la cuchilla para cortar todo el camino a través del ovocito.
Asegúrese de que el ooplasto denso en mitocondrias y el ooplasto reducido en mitocondrias sean aproximadamente del mismo tamaño, y que la cuchilla se divida en el segmento más claro del ovocito centrifugado. Al levantar la cuchilla, asegúrese de que se mantenga la misma línea y que la punta de la cuchilla permanezca en el mismo lugar, luego levante suavemente la punta de la placa. Repita los pasos de bisección para todos los ovocitos dentro de la primera gota de bisección.
Si los ovocitos están presentes en gotas adicionales, oriente y bisecle los ovocitos restantes. Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos reducidos en mitocondrias de la primera gota de bisección. Colóquelos en la gota T20 de la mano izquierda ubicada en la fila inferior de la placa.
Repita para todas las gotas de bisección restantes. Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos densos de mitocondrias de la primera gota de bisección. Colócalos en la gota T20 de la mano derecha ubicada en la fila inferior de la placa.
Repita para todas las gotas de bisección restantes. Recupere el plato de cuatro pocillos T10 de la incubadora. Usando una pipeta bucal, mueva todos los ooplastos reducidos en mitocondrias a la RM bien etiquetada y mueva los ooplastos densos en mitocondrias al M bien etiquetado.
Permita que los ooplastos descansen durante al menos 30 minutos antes de la cuantificación del ADNmt. Para una bisección exitosa, las muestras de ovocitos enteros y ooplastos densos en mitocondrias tienen valores de TC similares. Las muestras de ooplastos reducidos en mitocondrias tienen valores de TC más altos en comparación con las muestras de los otros dos grupos.
Para una bisección fallida, la bisección no reduce el contenido de ADNmt de manera efectiva en los ooplastos reducidos en mitocondrias. Tras la producción de una curva estándar y el uso de las fórmulas de número de copias de ADNmt proporcionadas, se ha logrado una reducción media del ADNmt de ovocitos del 93,88% utilizando este protocolo. Orientar correctamente cada ovocito en la gota de bisección, dividir con precisión cada ovocito y clasificar con precisión los ooplastos, son pasos críticos a seguir para obtener resultados exitosos.
Dos ooplastos se pueden fusionar con una célula somática. Los trillizos fusionados pueden ser activados químicamente y cultivados como embriones reconstruidos.
