Il protocollo riduce significativamente il numero di copie del DNA mitocondriale nell'ovocita. Ciò potrebbe essere utile per la clonazione intraspecie. Questo metodo riduce il numero di copie del DNA mitocondriale negli ovociti bovini di oltre il 90%, il che potrebbe ridurre l'incidenza dell'eteroplasmia mitocondriale negli embrioni clonati.
Laura Adams, una dottoranda del mio laboratorio, dimostrerà la procedura. Per iniziare, utilizzando una pipetta, raccogliere gli ovociti maturi selezionati dalla goccia HSOF e posizionarli nel tubo da 1,5 millilitri contenente 50 microlitri della soluzione HSOF CB. Centrifugare gli ovociti a 15.000 volte G per 12 minuti.
Mentre gli ovociti vengono centrifugati, preparare la piastra di bisezione. Per questo, inizia facendo un motivo sul coperchio di una capsula di Petri da 60 millimetri usando 20 microlitri per goccia e copri completamente le gocce con olio minerale. Usando un pennarello a punta sottile, segna le linee sotto il piatto.
Coprire il piatto con un coperchio opaco fino a quando la centrifugazione è completa per evitare cambiamenti di osmolarità delle microgocce. Non appena la centrifugazione è completa, utilizzare una pipetta da 200 microliti per raccogliere gli ovociti all'interno della soluzione e spostarli in una porzione vuota di una nuova piastra di ricerca con quattro gocce HSOF da 400 microlitri, prima di lavare gli ovociti attraverso gocce HSOF. Accendere la fase di riscaldamento a 38,5 gradi Celsius.
Utilizzare una pipetta orale per spostare gli ovociti centrifugati dalla goccia HSOF alla goccia T2 in alto a sinistra della piastra di bisezione. Quindi lavare gli ovociti attraverso le successive tre gocce sulla fila superiore. Deposita gli ovociti in una delle gocce di pronasi, assicurando che ci sia poco o nessun contatto tra di loro.
Osservare gli ovociti fino a quando non vi è una chiara deformazione delle zonae pellucidae. Una volta che un singolo ovocita zona pellucida si è deformato, spostare quell'ovocita alla goccia T2 vicina. Ripetere come ulteriori ovociti si deformano, fino a quando tutti gli ovociti sono stati rimossi dalla pronasi e collocati nella goccia T2.
Osservare gli ovociti fino a quando rimane solo un sottile strato della zona pellucida. Lavare gli ovociti attraverso le successive tre gocce all'interno della fila, quindi depositarli in linee verticali all'interno delle gocce CBT20. Inizia con meno ovociti nelle linee verticali e aumenta il numero di ovociti per goccia man mano che le abilità di bisezione progrediscono.
Concentrati sulla prima goccia di CBT20 più a sinistra che contiene ovociti e usa una pipetta orale per ruotare gli ovociti in modo che la porzione densa di mitocondri di ciascun ovocita sia rivolta verso o lontano dal braccio del microscopio. Appoggiare la punta della microlama a sinistra dell'ovocita più in alto, in linea con lo spazio direttamente sopra la porzione densa di mitocondri. Mantenendo la punta della lama nello stesso punto, abbassare con attenzione la lama per tagliare fino in fondo l'ovocita.
Assicurarsi che l'ooplasto denso di mitocondri e l'ooplasto ridotto ai mitocondri abbiano all'incirca le stesse dimensioni e che la lama sia in due nel segmento più chiaro dell'ovocita centrifugato. Quando si solleva la lama, assicurarsi che venga mantenuta la stessa linea e che la punta della lama rimanga nello stesso punto, quindi sollevare delicatamente la punta dalla piastra. Ripetere i passaggi di bisezione per tutti gli ovociti entro la prima goccia di bisezione.
Se gli ovociti sono presenti in gocce aggiuntive, orientare e dividere in due gli ovociti rimanenti. Usando una pipetta orale, raccogliere gli ooplasti ridotti ai mitocondri dalla prima goccia di bisezione. Posizionali nella goccia T20 della mano sinistra situata nella fila inferiore della piastra.
Ripetere l'operazione per tutte le gocce di bisezione rimanenti. Usando una pipetta orale, raccogliere gli ooplasti densi dei mitocondri dalla prima goccia di bisezione. Posizionali nella goccia T20 di destra situata nella fila inferiore della piastra.
Ripetere l'operazione per tutte le gocce di bisezione rimanenti. Recupera il piatto a quattro pozzetti T10 dall'incubatrice. Usando una pipetta orale, spostare tutti gli ooplasti ridotti dai mitocondri nella MR ben etichettata e spostare gli ooplasti densi di mitocondri nel M ben etichettato M.Riposizionare la piastra a quattro pozzetti nell'incubatore controllato dall'anidride carbonica.
Lasciare riposare gli ooplasti per almeno 30 minuti prima della quantificazione del mtDNA. Per una bisezione di successo, i campioni di ovociti interi e ooplasti densi di mitocondri hanno valori CT simili. I campioni di ooplasti ridotti ai mitocondri hanno valori CT più elevati rispetto ai campioni degli altri due gruppi.
Per una bisezione senza successo, la bisezione non riduce efficacemente il contenuto di mtDNA negli ooplasti ridotti dai mitocondri. A seguito della produzione di una curva standard e dell'uso delle formule di numero di copie del mtDNA fornite, è stata ottenuta una riduzione media del mtDNA ovocitario del 93,88% utilizzando questo protocollo. Orientare correttamente ogni ovocita nella goccia di bisezione, tagliare con precisione in due ogni ovocita e ordinare accuratamente gli ooplasti, sono tutti passi critici da intraprendere per ottenere risultati di successo.
Due ooplasti possono essere fusi con una cellula somatica. Le terzine fuse possono quindi essere attivate chimicamente e coltivate come embrioni ricostruiti.
