Kaspazlar, apoptoz ve apoptotik olmayan süreçler sırasında substratları parçalayan sistein proteazlardır. Bu protokol, Drosophila'dan başlatıcı kaspaz Dronc'un varsayılan substratlarını tanımlamak için in vitro bölünme testini tanımlar. Dikkatli bir şekilde takip edilirse, bu protokol kaspaz Drunc veya başka herhangi bir kaspaz varsayılan substratlarının yüksek verimli taranması için güvenilir bir prosedür sağlar.
Bu protokol, Drosophila caspase Drunc kullanılarak in vitro bölünme testleri için tasarlanmış olsa da, memeliler de dahil olmak üzere diğer organizmalardan gelen kaspazlar için kolayca uyarlanabilir. Rekombinant kaspazların saflaştırılması ve in vitro bölünme tahlillerinin aynı gün yapılması önemlidir, çünkü bu kaspaz preparatları enzimatik aktiviteyi hızla kaybeder. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr. Prathibha Yarikipati olacak.
Başlamak için, donmuş tüpleri peletlenmiş kültürlerle eksi 80 santigrat derece depodan çıkarın ve peleti yumuşatmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. 10 dakika sonra, yeni eklenen proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 0.6 mililitre bakteriyel hücre lizis tamponu, mililitre lizozim başına 10 miligram ve mililitre benzonaz başına 50 ünite, bir mililitre serolojik pipetli bir pipet kontrolörü kullanarak pelet içeren tüplere ekleyin. Aynı pipet ucuyla, herhangi bir pelet parçacığı olmadan berrak, soluk sarı bir çözelti görünene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti çözün ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
Lisatları uygun santrifüj tüplerine aktarın ve 4 santigrat derecede 40 dakika boyunca 17.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantları, kaspazları içeren ham ekstrakt olan 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri buz üzerinde tutun. Kaspaz ekstraktlarının her bir tüpüne % 50 ni-nitriloasetik asit agarozu bulamacının 0.2 mililitresini ekleyin ve tüpleri 4 santigrat derecede bir saat boyunca uçtan uca bir rotatör üzerinde döndürün.
Bir saat sonra, Ni-nitriloasetik asit agarozu ile ekstraktı, ucu bozulmamış, bir rafa yerleştirilmiş bir mililitre polipropilen sütuna ekleyin ve Ni-nitriloasetik asit agarozunun yerleşmesine izin vermek için beş dakika bekletin. Beş dakika sonra, sütunların kapağını çıkarın ve süpernatantın yerçekimi akışıyla dışarı akmasına izin verin. Daha sonra, Ni-nitriloasetik asit agarozunun paketlenmiş reçinesini bozmadan sütunlara bir mililitre yıkama tamponunu dikkatlice ekleyin ve yerçekimi akışıyla yıkayın.
Kaspazların elüsyonu için, yıkama tamponunun tamamen boşaltılmasından sonra, kolonların toplama nozulunun altına 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Daha sonra, her sütuna 0,5 mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve elüantı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın. Elüantları buz üzerinde tutun ve Bradford testi ile proteinlerin konsantrasyonunu ölçün.
Varsayılan substratın ekspresyon seviyesine bağlı olarak, bölünme tahlilinde ilgilenilen protein ile programlanmış tavşan retikülosit lizatının 1 ila 10 mikrolitresini kullanın ve buz üzerinde tutun. Daha önce üretilen 10 mikrogram saflaştırılmış kaspaz proteini ekleyin ve toplam reaksiyon hacmini kaspaz testi tamponu ile 50 mikrolitreye getirin. Reaksiyonları üç saat boyunca 30 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin ve bölünme testine uygun kontrollerin dahil edilmesini sağlayın.
Üç saat sonra, tüpleri buz üzerine aktararak reaksiyonları durdurun ve 50 milimolar DTT içeren bir hacim LDS numune tamponu ekleyin. Numuneleri 10 dakika boyunca bir ısı bloğunda 75 santigrat derecede inkübe edin. Hızlı bir şekilde döndürün, hafifçe karıştırın, numune başına 24 mikrolitre yükleyin ve SDS sayfasını çalıştırın veya numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Dört farklı rekombinant kaspaz SDS-PAGE ile indüklendi, saflaştırıldı ve analiz edildi, immünoblotize edildi ve leke bir antihistidin antikoru ile incelendi. İşlenmemiş 6x-Histidin Dronc, 55 kilodaltonluk göreceli bir moleküler ağırlıkta çalışır ve işlenmemiş 6x-His DRICE 35 kilodaltonluk bir moleküler ağırlığa sahiptir. Kaspazların otomatik olarak işlenmesi, daha küçük moleküler ağırlığa sahip bantların ortaya çıkmasıyla görülebilir.
Yarık Drunc için, 40 kilodaltonluk bir banttır. Parçalanmış Drice için, 23 kilodaltonluk bir banttır. İn vitro bölünme reaksiyonundan sonra, proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı, immünoblotlandı ve pıhtılar, amino ölümcül Myc etiketli Drice C211A'yı tespit etmek için bir anti-Myc antikoru ile inkübe edildi.
Sonuçlar, bakteriyel olarak üretilen ve saflaştırılan 6x-histidin Dronc vahşi tip preparatın enzimatik aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Bu, amcalı proDrice'ye kıyasla daha küçük parçalanmış Drice bandının varlığı ile görülebilir. Hem rekombinant kaspaz hem de substrat kullanan in vitro bölünme reaksiyonu SDS-PAGE ve immünoblot ile analiz edildi.
Bölünme reaksiyonunun analizi için, bu immünoblotta anti yarıklı Drice antikoru kullanıldı. Sonuçlar, bakteriyel olarak üretilen ve saflaştırılan 6x-His Dronc preparatının enzimatik aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Bu, amcalı proDrice'ye kıyasla daha küçük parçalanmış Drice bandının varlığı ile görülebilir.
Rekombinant kaspazların enzimatik aktiviteyi hızlı bir şekilde kaybettiğini lütfen unutmayın. Eksi 80 santigrat derecede bile saklanamazlar. İn vitro bölünme tahlilleri aynı gün yapılmalıdır.
İn vitro bölünme testinde pozitif vuruşlar in vivo olarak doğrulanmalıdır. Bu, hücrelerde veya Drosophila veya C.elegans gibi genetik model organizmalarda yapılabilir.
