Nanos1 ekspresyonunun EdU etiketleme ile birlikte boyanması, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücrelerin ayırt edilmesini mümkün kılar. Denizanası Cladonema'da kök benzeri hücrelerin tek hücre seviyesinde dağılımını tanımlayabiliriz. Kök benzeri hücreleri ve çoğalan hücreleri aynı denizanası örneğinde görselleştirebiliriz, bu da çoğalan ve çoğalmayan kök benzeri hücrelerin tespit edilmesini sağlayarak kök hücre heterojenliğinin anlaşılmasına yol açar.
Kök hücreleri içeren hayvan modellerini kullanarak gelişimsel biyoloji ve rejenerasyon çalışmaları. Hidrozoon denizanası Cladonema pacificum, herhangi bir özel sistem olmadan laboratuvar ortamında tutulabilen, gelişmekte olan bir model organizmadır. Cladonema medusae dallanmış dokunaçlara sahiptir.
Dallanma, dokunacın adaksial tarafı boyunca yeni bir bölgede meydana gelir. Zamanla, dokunaçlar uzamaya ve dallanmaya devam eder, eski dallar uca doğru itilir. Dokunaçlar ayrıca amputasyondan sonraki birkaç gün içinde yenilenebilir.
Küçük boyutlu, kolay kullanımı ve yetişkin kök hücrelerin veya kök benzeri hücrelerin varlığı, Cladonema'yı kök hücrelerin farklı süreçlerdeki rolünü araştırmak için iyi bir sistem haline getirir. Başlamak için, Cladonema medusae'yi 3,5 mililitrelik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin ve toplam 500 mikrolitre hacme kadar ASW ekleyin. 7,5 mikrolitre 10 milimolar EdU stok çözeltisi ekleyin ve numuneleri 22 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.
Bir saat bekleyin ve mümkün olduğunca EdU içeren ASW'yi çıkarın. Medusae'yi anestezi altına aldıktan sonra, beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Medusae'yi ASW'de% 4 paraformaldehit ile gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin.
Proteinaz tedavisi ve fiksasyon sonrası için, paraformaldehiti çıkarın ve numuneleri% 0.1 içeren PBS ile yıkayınHer biri 10 dakika boyunca 20 üç kez ara. PBST'yi çıkarın ve hibridizasyon arabelleğini ekleyin. Hibridizasyon tamponundaki numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
Hibridizasyon tamponunu çıkarın ve yeni hibridizasyon tamponunu ekleyin. Bir hibridizasyon inkübatöründe en az iki saat boyunca 55 santigrat derecede ön hibridize edin. Hibridizasyon tamponunu çıkarın ve probları içeren hibridizasyon tamponu ile inkübe edin.
Bir hibridizasyon inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca 55 santigrat derecede hibridize edin. Ardından, prob çıkarma işlemine devam edin. Probları içeren hibridizasyon tamponunu çıkarmakla başlayın ve ardından yıkama tamponu ekleyin.
Numuneleri 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkama tamponu birini çıkarın ve ikinci yıkama tamponunu ekleyin. Numuneleri 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkama tamponu ile yıkayın.
İki yıkama tamponunu çıkarın ve ardından 2X SSC ekleyin. Numuneleri 2X SSC ile 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. 2X SSC'yi kaldırın ve önceden ısıtılmış PBST'yi ekleyin.
Numuneleri oda sıcaklığında PBST ile 15 dakika yıkayın. Anti-DIG antikor inkübasyonu için, PBST'yi çıkararak başlayın ve% 1 bloke edici tampon ekleyin. Bir rocker üzerinde yavaşça sallanırken numuneleri oda sıcaklığında en az bir saat boyunca inkübe edin.
Engelledikten sonra,% 1 engelleme arabelleğini çıkarın. Anti-DIG-POD çözeltisi ekleyin ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. DIG etiketli probu tespit etmek için, anti-DIG-POD çözeltisini çıkarın ve tris sodyum klorür Ara tamponu ekleyin.
Numuneleri tris sodyum klorür Ara tamponu ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Aktif Cy5 tiramid çözeltisini yapmak için floresan boya konjuge tiramid stok çözeltisini amplifikasyon seyreltici tamponunda seyreltin. Mümkün olduğunca çok tris sodyum klorür Ara tamponunu çıkarın ve ardından aktif Cy5 tiramid çözeltisini ekleyin.
Örnekleri karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın. EdU algılama kokteylini hazırlamak için bileşenleri karıştırın.
PBST'yi kaldırın ve ardından EdU algılama kokteylini ekleyin. Numuneyi karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. PBST ile karanlıkta 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
DNA boyama için, Hoechst çözeltisini hazırlamak için PBST'de Hoechst'i seyreltin. PBST'yi kaldırın ve Hoechst çözümünü ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
Numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBST ile üç ila dört kez yıkayın. Montaj için daha sonra, ucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak medusae'yi slayt camındaki bankaya aktarın. Medusae üzerine forseps ile yavaşça bir örtü parçası yerleştirin ve kapak kaymasının yan tarafını şeffaf oje ile kapatın.
Nanos1 ekspresyonu ve EdU pozitif hücrelerin birlikte etiketlenmesi, dokunaçtaki kök benzeri hücrelerin ve proliferatif hücrelerin uzamsal modelini ortaya çıkardı. EdU pozitif hücreler dokunaç ampulü boyunca daha yaygın olarak dağılırken, dokunaç ampulünde ve yeni dallanma bölgesinde daha lokal olarak biriken Nanos1 pozitif hücreler, kök benzeri hücrelerin ve çoğalan hücrelerin farklı dağılımlarının gelişimsel zamanlamaya ve farklı aşamalara bağlı olarak tespit edildiğini göstermektedir. EdU ve Nanos1'un birlikte etiketlenmesi, hücrelerin% 19.79'unda gözlendi ve bu hücrelerin aktif olarak çoğalan bir kök hücre popülasyonu olduğunu düşündürdü.
İlginç bir şekilde, hücrelerin% 14.46'sının, ampulün ortasında ve yeni dallanma bölgesinde EdU pozitif Nanos1 negatif olduğu bulundu ve bu da kök benzeri olmayan proliferatif hücrelerin varlığını düşündürdü. Buna karşılık, hücrelerin% 26.32'sinin, ampulün tabanında ve yeni dallanma bölgesinde EdU negatif Nanos1 pozitif olduğu gözlendi; bu, yavaş döngülü veya sessiz bir kök hücre popülasyonunun varlığını gösteriyordu. Kısa inkübasyon süresine sahip EdU nabız etiketlemesi, kök benzeri hücreler ve kök benzeri olmayan hücreler arasında sadece proliferatif hücrelerin tespit edilmesini sağlar.
EdU için kuluçka süresini değiştirirken ve uzun süreli kovalama deneylerini birleştirirken, yavaş döngülü kök hücreler veya soy ve farklılaşmış hücreler de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri işaretlenebilir.
