Совместное окрашивание экспрессии Nanos1 маркировкой EdU позволяет различать активно размножающиеся стволовые клетки. Мы можем идентифицировать распределение стволовых клеток на уровне одной клетки в медузе Cladonema. Мы можем визуализировать стволовые клетки и пролиферирующие клетки в одном образце медузы, что позволяет обнаруживать пролиферирующие и непролиферирующие стволовые клетки, что приводит к пониманию гетерогенности стволовых клеток.
Биология развития и исследования регенерации с использованием животных моделей, которые включают стволовые клетки. Гидрозойская медуза Cladonema pacificum является новым модельным организмом, который может содержаться в лабораторных условиях без какой-либо специализированной системы. Cladonema medusae имеют разветвленные щупальца.
Ветвление происходит на новом участке вдоль адаксиальной стороны щупальца. Со временем щупальца продолжают удлиняться и разветвляться, а старые ветви выталкиваются к кончику. Щупальца также могут регенерировать в течение нескольких дней после ампутации.
Небольшой размер, простота в обращении и наличие взрослых стволовых клеток или стволовых клеток делают Cladonema хорошей системой для исследования роли стволовых клеток в различных процессах. Для начала поместите Cladonema medusae в 1,5-миллилитровые трубки с помощью передаточной пипетки объемом 3,5 миллилитра и добавьте ASW до общего объема 500 микролитров. Добавьте 7,5 микролитров 10-миллимолярного раствора EdU и инкубируйте образцы в течение одного часа при 22 градусах Цельсия.
Подождите час и удалите как можно больше ASW, содержащего EdU. После обезболивания медузы инкубировать в течение пяти минут. Зафиксируйте медузы на ночь при четырех градусах Цельсия с 4% параформальдегидом в ASW.
Для лечения протеиназой и постфиксации удалите параформальдегид и промывайте образцы PBS, содержащим 0,1% Tween 20 трижды в течение 10 минут каждый. Удалите PBST и добавьте буфер гибридизации. Инкубируйте образцы в буфере гибридизации в течение 15 минут при комнатной температуре.
Удалите буфер гибридизации и добавьте новый буфер гибридизации. Предварительно гибридизируйте при 55 градусах Цельсия в течение не менее двух часов в гибридизационном инкубаторе. Удалите буфер гибридизации и инкубируйте с буфером гибридизации, содержащим зонды.
Гибридизируйте при 55 градусах Цельсия в течение 18-24 часов в гибридизационном инкубаторе. Затем приступайте к удалению зонда. Начните с удаления буфера гибридизации, содержащего зонды, а затем добавьте буфер промывки.
Промывайте образцы с помощью промывочного буфера дважды в течение 15 минут при температуре 55 градусов Цельсия. Удалите один буфер стирки и добавьте буфер стирки два. Промывайте образцы с промывочным буфером два раза в течение 15 минут при температуре 55 градусов Цельсия.
Удалите два буфера стирки, а затем добавьте 2X SSC. Промывайте образцы с 2X SSC дважды в течение 15 минут при 55 градусах Цельсия. Удалите 2X SSC, а затем добавьте предварительно нагретый PBST.
Промывайте образцы в течение 15 минут PBST при комнатной температуре. Для инкубации антител против DIG начните с удаления PBST, а затем добавьте 1% блокирующий буфер. Инкубируйте образцы в течение не менее одного часа при комнатной температуре, медленно встряхивая на коромысле.
После блокировки удалите буфер блокировки 1%.. Добавьте анти-DIG-POD раствор и инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Чтобы обнаружить зонд с маркировкой DIG, удалите раствор анти-DIG-POD и добавьте буфер Tween трис хлорида натрия.
Промывайте образцы трис-хлоридно-натриевым буфером трижды в течение 10 минут при комнатной температуре. Разбавляют флуоресцентный краситель конъюгированным раствором тирамида в буфере амплификационного разбавителя для получения активного раствора тирамида Cy5. Удалите как можно больше буфера трис натрия хлорида, а затем добавьте активный раствор тирамида Cy5.
Инкубируйте образцы в течение 10 минут в темноте. Промыть образцы ПБСТ трижды в течение 10 минут в темноте. Чтобы приготовить коктейль для обнаружения EdU, смешайте компоненты.
Удалите PBST, а затем добавьте коктейль обнаружения EdU. Инкубируйте образец в темноте в течение 30 минут. Промыть ПБСТ трижды в течение 10 минут в темноте.
Для окрашивания ДНК разбавьте Hoechst в PBST для приготовления раствора Hoechst. Удалите PBST, а затем добавьте раствор Hoechst. Инкубируйте образцы в течение 30 минут в темноте.
Промыть образцы ПБСТ три-четыре раза в течение 10 минут в темноте. Далее для монтажа переложите медузу в банку на скользящем стекле с помощью переносной пипетки с отрезанным наконечником. Аккуратно положите на медузу щипцами и запечатайте боковую часть обшивки прозрачным лаком для ногтей.
Совместная маркировка экспрессии Nanos1 и положительных клеток EdU выявила пространственную картину стволовых клеток и пролиферативных клеток в щупальце. Положительные клетки EdU были более широко распространены по всей луковице щупальца, в то время как положительные клетки Nanos1 накапливались более локально в луковице щупальца и новом месте ветвления, что позволяет предположить, что различные распределения стволовых клеток и пролиферирующих клеток обнаруживаются в зависимости от сроков развития и различных стадий. Совместная маркировка EdU и Nanos1 наблюдалась в 19,79% клеток, предполагая, что эти клетки являются активно пролиферирующей популяцией стволовых клеток.
Интересно, что 14,46% клеток оказались положительными на EdU Nanos1 в середине луковицы и в новом месте ветвления, что свидетельствует о наличии нестебельных пролиферативных клеток. Напротив, было отмечено, что 26,32% клеток были положительными на EdU Nanos1 в основании колбы и в новом месте ветвления, что указывает на наличие популяции стволовых клеток, которая либо медленно циклична, либо находится в состоянии покоя, ни одна из которых не обнаруживается пульсовой маркировкой EdU. Пульсовая маркировка EdU с коротким временем инкубации позволяет обнаруживать только пролиферативные клетки среди стволовых клеток и нестволоподобных клеток.
При изменении времени инкубации для EdU и объединении длительных экспериментов в погоне могут быть отмечены медленные циклические стволовые клетки или другие типы клеток, включая потомство и дифференцированные клетки.
