Nanos1 발현과 EdU 표지의 동시 염색을 통해 활발하게 증식하는 줄기 유사 세포를 구별할 수 있습니다. 우리는 해파리 Cladonema의 단일 세포 수준에서 줄기 유사 세포 분포를 확인할 수 있습니다. 우리는 동일한 해파리 샘플에서 줄기 유사 세포와 증식하는 세포를 시각화 할 수 있으며, 이를 통해 증식하는 줄기 유사 세포와 비증식하는 줄기 유사 세포를 검출 할 수있어 줄기 세포 이질성에 대한 이해를 유도합니다.
줄기 세포를 포함하는 동물 모델을 사용한 발달 생물학 및 재생 연구. 수중 동물 해파리 Cladonema pacificum은 특별한 시스템없이 실험실 환경에서 보관할 수있는 새로운 모델 유기체입니다. 클라도네마 메두사에는 분지 촉수가 있습니다.
분기는 촉수의 축 방향 측면을 따라 새로운 사이트에서 발생합니다. 시간이 지남에 따라 촉수는 계속 늘어나고 가지가 갈라지며 오래된 가지가 끝쪽으로 밀려납니다. 촉수는 절단 후 며칠 이내에 재생될 수도 있습니다.
작은 크기, 쉬운 취급, 성체 줄기 세포 또는 줄기 유사 세포의 존재로 인해 Cladonema는 다양한 과정에서 줄기 세포의 역할을 조사하기에 좋은 시스템입니다. 시작하려면 3.5 밀리리터 이송 피펫을 사용하여 Cladonema medusae를 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 ASW를 총 부피 500 마이크로 리터까지 추가하십시오. 7.5 마이크로리터의 10 밀리몰 EdU 원액을 첨가하고 섭씨 22도에서 1시간 동안 샘플을 배양한다.
한 시간 동안 기다렸다가 EdU가 포함된 ASW를 최대한 많이 제거합니다. 메두사를 마취 한 후 5 분 동안 배양하십시오. ASW에서 4%파라포름알데히드로 섭씨 4도에서 밤새 메두사를 고정합니다.
프로테이나제 처리 및 사후 고정을 위해, 파라포름알데히드를 제거하고 샘플을 0.1%트윈을 함유하는 PBS로 각각 10분 동안 20회 세척한다. PBST를 제거하고 하이브리드화 버퍼를 추가합니다. 샘플을 실온에서 15분 동안 혼성화 완충액에서 인큐베이션한다.
하이브리드화 완충액을 제거하고 새로운 혼성화 완충액을 첨가한다. 하이브리드 화 인큐베이터에서 최소 2 시간 동안 섭씨 55도에서 사전 하이브리드 화합니다. 하이브리드화 완충액을 제거하고, 프로브를 포함하는 혼성화 완충액과 함께 인큐베이션한다.
하이브리드 화 인큐베이터에서 섭씨 55도에서 18-24 시간 동안 하이브리드 화합니다. 다음으로 프로브 제거를 진행하십시오. 프로브를 포함하는 하이브리드화 버퍼를 제거하는 것으로 시작한 다음 세척 버퍼 하나를 추가합니다.
샘플을 섭씨 55도에서 15분 동안 세척 완충액으로 두 번 세척합니다. 세척 버퍼 1을 제거하고 세척 버퍼 2를 추가합니다. 샘플을 세척 완충액으로 2회 섭씨 55도에서 15분 동안 2회 세척한다.
세척 버퍼 2를 제거한 다음 2X SSC를 추가합니다. 샘플을 섭씨 55도에서 15분 동안 2X SSC로 두 번 세척합니다. 2X SSC를 제거한 다음 예열된 PBST를 추가합니다.
샘플을 실온에서 PBST로 15분 동안 세척한다. 항-DIG 항체 배양의 경우 PBST를 제거한 다음 1% 차단 완충액을 추가하여 시작합니다. 샘플을 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하면서 로커에서 천천히 흔들어준다.
차단 후 1% 차단 버퍼를 제거합니다. 안티-DIG-POD 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. DIG 표지 프로브를 검출하려면 안티-DIG-POD 용액을 제거하고 트리스 염화나트륨 트윈 버퍼를 추가합니다.
샘플을 트리스 염화나트륨 트윈 완충액으로 실온에서 10분 동안 3회 세척한다. 형광 염료 공액 티라마이드 원액을 증폭 희석 완충액에 희석하여 활성 Cy5 티라미드 용액을 만든다. 가능한 한 많은 트리스 염화나트륨 트윈 버퍼를 제거한 다음 활성 Cy5 티라마이드 용액을 추가합니다.
어둠 속에서 10 분 동안 샘플을 배양하십시오. 어둠 속에서 10분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척한다. EdU 감지 칵테일을 준비하려면 구성 요소를 혼합하십시오.
PBST를 제거한 다음 EdU 검색 칵테일을 추가합니다. 샘플을 어두운 곳에서 30 분 동안 배양하십시오. 어둠 속에서 PBST로 10 분 동안 3 번 씻으십시오.
DNA 염색을 위해, 회히스트를 PBST로 희석하여 회히스트 용액을 제조한다. PBST를 제거한 다음 Hoechst 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 샘플을 배양하십시오.
샘플을 PBST로 3-4회 암실에서 10분 동안 세척한다. 다음으로 장착을 위해 팁이 잘린 상태에서 이송 피펫을 사용하여 메두사를 슬라이드 유리의 은행으로 옮깁니다. 집게로 메두사에 커버슬립을 부드럽게 놓고 투명한 매니큐어로 커버슬립의 측면을 밀봉합니다.
Nanos1 발현과 EdU 양성 세포의 공동 표지는 촉수에서 줄기 유사 세포와 증식 세포의 공간 패턴을 나타 냈습니다. EdU 양성 세포는 촉수 구근 전체에 더 널리 분포된 반면, Nanos1 양성 세포는 촉수 구근과 새로운 분기 부위에 더 국부적으로 축적되어 발달 시기와 다른 단계에 따라 줄기 유사 세포와 증식하는 세포의 뚜렷한 분포가 감지됨을 시사합니다. EdU와 Nanos1의 공동 표지는 세포의 19.79%에서 관찰되었으며, 이는 이들 세포가 활발하게 증식하는 줄기 세포 집단임을 시사합니다.
흥미롭게도 세포의 14.46%가 전구 중앙과 새로운 분기 부위에서 EdU 양성 Nanos1 음성으로 발견되어 줄기와 유사하지 않은 증식 세포의 존재를 시사합니다. 대조적으로, 세포의 26.32%는 전구 기저부와 새로운 분기 부위에서 EdU 음성 Nanos1 양성으로 관찰되었으며, 이는 느린 사이클링 또는 정지 상태인 줄기 세포 집단의 존재를 나타내며, 둘 다 EdU 펄스 라벨링으로 감지되지 않습니다. 짧은 배양 시간으로 EdU 펄스 라벨링을 통해 줄기 유사 세포와 비 줄기 유사 세포 중에서 증식 세포 만 검출 할 수 있습니다.
EdU의 배양 시간을 변경하고 장기간 추적 실험을 결합하면 느린 순환 줄기 세포 또는 자손 및 분화 된 세포를 포함한 다른 세포 유형을 표시 할 수 있습니다.
