La co-coloration de l’expression de Nanos1 avec le marquage EdU permet de distinguer les cellules souches qui prolifèrent activement. Nous pouvons identifier la distribution des cellules souches au niveau de la cellule unique chez la méduse Cladonema. Nous pouvons visualiser des cellules souches et des cellules proliférantes dans le même échantillon de méduses, ce qui permet de détecter des cellules souches proliférantes et non proliférantes, ce qui permet de comprendre l’hétérogénéité des cellules souches.
Biologie du développement et études de régénération utilisant des modèles animaux incluant des cellules souches. La méduse hydrozoaire Cladonema pacificum est un organisme modèle émergent qui peut être conservé dans un environnement de laboratoire sans aucun système spécialisé. Cladonema medusae a des tentacules ramifiés.
La ramification se produit à un nouveau site le long du côté adaxial du tentacule. Au fil du temps, les tentacules continuent de s’allonger et de se ramifier, les branches plus anciennes étant poussées vers la pointe. Les tentacules peuvent également se régénérer quelques jours après l’amputation.
La petite taille, la facilité de manipulation et la présence de cellules souches adultes ou de cellules souches font de Cladonema un bon système pour étudier le rôle des cellules souches dans différents processus. Pour commencer, placez Cladonema medusae dans des tubes de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette de transfert de 3,5 millilitres et ajoutez ASW jusqu’à un volume total de 500 microlitres. Ajouter 7,5 microlitres de solution mère d’EdU 10 millimolaires et incuber les échantillons pendant une heure à 22 degrés Celsius.
Attendez une heure et retirez autant d’ASW contenant EdU que possible. Après avoir anesthésié les méduses, incuber pendant cinq minutes. Fixer les méduses pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec 4% de paraformaldéhyde dans ASW.
Pour le traitement par protéinase et la post-fixation, retirer le paraformaldéhyde et laver les échantillons avec du PBS contenant 0,1% Tween 20 trois fois pendant 10 minutes chacun. Retirez le PBST et ajoutez le tampon d’hybridation. Incuber les échantillons dans le tampon d’hybridation pendant 15 minutes à température ambiante.
Supprimez le tampon d’hybridation et ajoutez le nouveau tampon d’hybridation. Pré-hybrider à 55 degrés Celsius pendant au moins deux heures dans un incubateur d’hybridation. Retirez le tampon d’hybridation et incuber avec le tampon d’hybridation contenant les sondes.
Hybrider à 55 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures dans un incubateur d’hybridation. Ensuite, procédez au retrait de la sonde. Commencez par retirer le tampon d’hybridation contenant les sondes, puis ajoutez un tampon de lavage.
Lavez les échantillons avec un tampon de lavage deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius. Retirez le tampon de lavage un et ajoutez le tampon de lavage deux. Lavez les échantillons avec un tampon de lavage deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius.
Retirez le tampon de lavage deux, puis ajoutez 2X SSC. Lavez les échantillons avec 2X SSC deux fois pendant 15 minutes à 55 degrés Celsius. Retirez 2X SSC, puis ajoutez PBST préchauffé.
Lavez les échantillons pendant 15 minutes avec du PBST à température ambiante. Pour l’incubation d’anticorps anti-DIG, commencez par supprimer le PBST, puis ajoutez un tampon bloquant à 1%. Incuber les échantillons pendant au moins une heure à température ambiante tout en agitant lentement sur une bascule.
Après le blocage, supprimez le tampon 1%blocking. Ajouter la solution anti-DIG-POD et incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pour détecter la sonde marquée DIG, retirez la solution anti-DIG-POD et ajoutez le tampon Tris sodium chlorure Tween.
Laver les échantillons avec le tampon Tris sodium chlorure Tween trois fois pendant 10 minutes à température ambiante. Diluer la solution mère de tyramide conjuguée à colorant fluorescent dans le tampon de diluant d’amplification pour obtenir la solution active de tyramide Cy5. Retirer autant de tampon Tris sodium chlorure Tween que possible, puis ajouter la solution active de Cy5 tyramide.
Incuber les échantillons pendant 10 minutes dans l’obscurité. Lavez les échantillons avec du PBST trois fois pendant 10 minutes dans l’obscurité. Pour préparer le cocktail de détection EdU, mélangez les composants.
Retirez PBST, puis ajoutez le cocktail de détection EdU. Incuber l’échantillon dans l’obscurité pendant 30 minutes. Laver avec PBST trois fois pendant 10 minutes dans l’obscurité.
Pour la coloration de l’ADN, diluer Hoechst dans du PBST pour préparer la solution de Hoechst. Retirez le PBST, puis ajoutez la solution Hoechst. Incuber les échantillons pendant 30 minutes dans l’obscurité.
Lavez les échantillons avec du PBST trois à quatre fois pendant 10 minutes dans l’obscurité. Ensuite, pour le montage, transférez les méduses sur la banque sur le verre coulissant à l’aide d’une pipette de transfert avec la pointe coupée. Placez délicatement un bordereau sur la méduse avec une pince et scellez le côté du couvercle avec du vernis à ongles transparent.
Le co-marquage de l’expression de Nanos1 et des cellules positives EdU a révélé le modèle spatial des cellules souches et des cellules prolifératives dans le tentacule. Les cellules EdU positives étaient plus largement réparties dans le bulbe tentacule, tandis que les cellules positives Nanos1 accumulées plus localement au bulbe tentacule et au nouveau site de ramification, suggèrent que des distributions distinctes de cellules souches et de cellules proliférantes sont détectées en fonction du moment du développement et des différents stades. Le comarquage d’EdU et de Nanos1 a été observé dans 19,79% des cellules, ce qui suggère que ces cellules constituent une population de cellules souches en prolifération active.
Curieusement, 14,46% des cellules se sont avérées EdU positives Nanos1 négatives au milieu du bulbe et au nouveau site de ramification, suggérant la présence de cellules prolifératives non souches. En revanche, 26,32 % des cellules ont été observées comme étant Nanos1 positives à la base du bulbe et au nouveau site de ramification, ce qui indique la présence d’une population de cellules souches à cycle lent ou au repos, dont aucune n’est détectée par le marquage des impulsions EdU. Le marquage par impulsions EdU avec un temps d’incubation court permet de détecter uniquement des cellules prolifératives parmi les cellules souches et les cellules non souches.
Lors de la modification du temps d’incubation de l’EdU et de la combinaison d’expériences de poursuite à long terme, les cellules souches à cycle lent ou d’autres types de cellules, y compris la descendance et les cellules différenciées, peuvent être marquées.
