A cocoloração da expressão de Nanos1 com a marcação EdU permite distinguir células estaminais em proliferação ativa. Podemos identificar a distribuição de células-tronco no nível de uma única célula na água-viva Cladonema. Podemos visualizar células-tronco e células proliferantes na mesma amostra de águas-vivas, o que permite a detecção de células-tronco proliferantes e não proliferantes, levando à compreensão da heterogeneidade das células-tronco.
Biologia do desenvolvimento e estudos de regeneração usando modelos animais que incluem células-tronco. A água-viva hidrozoária Cladonema pacificum é um organismo modelo emergente que pode ser mantido em um ambiente de laboratório sem qualquer sistema especializado. Cladonema medusae têm tentáculos ramificados.
A ramificação ocorre em um novo local ao longo do lado adaxial do tentáculo. Com o tempo, os tentáculos continuam a se alongar e se ramificar, com galhos mais antigos sendo empurrados para fora em direção à ponta. Os tentáculos também podem se regenerar dentro de alguns dias após a amputação.
Tamanho pequeno, fácil manuseio e a presença de células-tronco adultas ou células-tronco fazem do Cladonema um bom sistema para investigar o papel das células-tronco em diferentes processos. Para começar, coloque Cladonema medusae em tubos de 1,5 mililitros usando uma pipeta de transferência de 3,5 mililitros e adicione ASW até um volume total de 500 microlitros. Adicionar 7,5 microlitros de solução de reserva de EdU 10 milimolares e incubar as amostras durante uma hora a 22 graus Celsius.
Aguarde uma hora e remova o máximo de ASW contendo EdU quanto possível. Depois de anestesiar as medusas, incubar por cinco minutos. Fixe as medusas durante a noite a quatro graus Celsius com 4% de paraformaldeído em ASW.
Para o tratamento da proteinase e pós-fixação, retirar o paraformaldeído e lavar as amostras com PBS contendo 0,1% Tween 20 três vezes durante 10 minutos cada. Remova o PBST e adicione o buffer de hibridização. Incubar as amostras no tampão de hibridização por 15 minutos à temperatura ambiente.
Remova o buffer de hibridização e adicione o buffer de hibridização fresco. Pré-hibridize a 55 graus Celsius por pelo menos duas horas em uma incubadora de hibridização. Remova o tampão de hibridização e incube com o tampão de hibridização que contém as sondas.
Hibridize a 55 graus Celsius por 18 a 24 horas em uma incubadora de hibridização. Em seguida, prossiga com a remoção da sonda. Comece removendo o buffer de hibridização contendo sondas e, em seguida, adicione o buffer de lavagem um.
Lave as amostras com tampão de lavagem duas vezes durante 15 minutos a 55 graus Celsius. Remova o tampão de lavagem um e adicione o tampão de lavagem dois. Lave as amostras com tampão de lavagem duas vezes por 15 minutos a 55 graus Celsius.
Remova o buffer de lavagem dois e, em seguida, adicione 2X SSC. Lave as amostras com 2X SSC duas vezes por 15 minutos a 55 graus Celsius. Remova o SSC 2X e, em seguida, adicione o PBST pré-aquecido.
Lave as amostras por 15 minutos com PBST à temperatura ambiente. Para incubação de anticorpos anti-DIG, comece removendo o PBST e, em seguida, adicione o tampão de bloqueio de 1%. Incubar as amostras durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente, agitando lentamente sobre um balancim.
Após o bloqueio, remova o buffer de bloqueio de 1%. Adicionar solução anti-DIG-POD e incubar as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Para detectar a sonda marcada com DIG, remova a solução anti-DIG-POD e adicione o tampão Tween de cloreto de sódio tris.
Lavar as amostras com tampão de interpolação de cloreto de sódio tris três vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente. Diluir a solução de tiromida conjugada de corante fluorescente diluído no tampão diluente de amplificação para produzir a solução activa de tiramida Cy5. Remova o máximo possível de tampão de interpolação de cloreto de sódio tris e, em seguida, adicione a solução ativa de tiramida Cy5.
Incubar as amostras por 10 minutos no escuro. Lave as amostras com PBST três vezes por 10 minutos no escuro. Para preparar o coquetel de detecção de EdU, misture os componentes.
Remova o PBST e adicione o coquetel de detecção de EdU. Incubar a amostra no escuro por 30 minutos. Lave com PBST três vezes por 10 minutos no escuro.
Para a coloração do ADN, diluir a Hoechst em PBST para preparar a solução Hoechst. Remova o PBST e, em seguida, adicione a solução Hoechst. Incubar as amostras por 30 minutos no escuro.
Lave as amostras com PBST três a quatro vezes por 10 minutos no escuro. Em seguida, para montagem, transfira as medusas para o banco no vidro deslizante usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Coloque suavemente uma tampa na medusa com pinça e sele o lado da tampa com esmalte claro.
A co-marcação da expressão de Nanos1 e das células positivas para EdU revelou o padrão espacial de células-tronco e células proliferativas no tentáculo. As células positivas para EdU foram mais amplamente distribuídas por todo o bulbo do tentáculo, enquanto as células positivas de Nanos1 se acumularam mais localmente no bulbo do tentáculo e no novo local de ramificação, sugerem que distribuições distintas de células-tronco e células proliferantes são detectadas dependendo do tempo de desenvolvimento e dos diferentes estágios. A co-marcação de EdU e Nanos1 foi observada em 19,79% das células, sugerindo que essas células são uma população de células-tronco em proliferação ativa.
Curiosamente, 14,46% das células foram encontradas como Nanos1 positivas para EdU no meio do bulbo e no novo local de ramificação, sugerindo a presença de células proliferativas não semelhantes a caules. Em contraste, observou-se que 26,32% das células eram Nanos1 negativas para EdU na base do bulbo e no novo local de ramificação, indicando a presença de uma população de células-tronco que é de ciclo lento ou quiescente, nenhuma das quais é detectada pela marcação de pulso EdU. A marcação de pulso EdU com curto tempo de incubação permite a detecção apenas de células proliferativas entre células-tronco e células não semelhantes a troncos.
Ao alterar o tempo de incubação para EdU e combinar experimentos de perseguição de longa data, células-tronco de ciclo lento ou outros tipos de células, incluindo progênie e células diferenciadas, podem ser marcadas.
