Die Co-Färbung der Nanos1-Expression mit der EdU-Markierung ermöglicht es, aktiv proliferierende stammartige Zellen zu unterscheiden. Wir können die stammartige Zellverteilung auf Einzelzellebene in der Qualle Cladonema identifizieren. Wir können stammähnliche Zellen und proliferierende Zellen in derselben Quallenprobe visualisieren, was den Nachweis von proliferierenden und nicht proliferierenden stammartigen Zellen ermöglicht, was zum Verständnis der Stammzellheterogenität führt.
Entwicklungsbiologie und Regenerationsstudien mit Tiermodellen, die Stammzellen enthalten. Die Hydrozoenqualle Cladonema pacificum ist ein aufstrebender Modellorganismus, der in einer Laborumgebung ohne spezialisiertes System gehalten werden kann. Cladonema medusae haben verzweigte Tentakel.
Die Verzweigung erfolgt an einer neuen Stelle entlang der adaxialen Seite des Tentakels. Im Laufe der Zeit verlängern sich die Tentakel weiter und verzweigen sich, wobei ältere Äste zur Spitze herausgeschoben werden. Die Tentakel können sich auch innerhalb weniger Tage nach der Amputation regenerieren.
Die geringe Größe, die einfache Handhabung und das Vorhandensein von adulten Stammzellen oder stammähnlichen Zellen machen Cladonema zu einem guten System, um die Rolle von Stammzellen in verschiedenen Prozessen zu untersuchen. Legen Sie zunächst Cladonema medusae mit einer 3,5-Milliliter-Transferpipette in 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie ASW zu einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Fügen Sie 7,5 Mikroliter 10 Millimolar EdU-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie die Proben für eine Stunde bei 22 Grad Celsius.
Warten Sie eine Stunde und entfernen Sie so viel ASW mit EdU wie möglich. Nach der Betäubung der Medusen fünf Minuten inkubieren. Die Medusen über Nacht bei vier Grad Celsius mit 4% Paraformaldehyd in ASW fixieren.
Für die Proteinasebehandlung und Postfixierung entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Proben mit PBS, das 0,1% Tween 20 enthält, dreimal für jeweils 10 Minuten. Entfernen Sie das PBST und fügen Sie den Hybridisierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Proben im Hybridisierungspuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer und fügen Sie den neuen Hybridisierungspuffer hinzu. Vorhybridisieren Sie bei 55 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden in einem Hybridisierungsinkubator. Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer und inkubieren Sie mit dem Hybridisierungspuffer, der die Sonden enthält.
Hybridisieren Sie bei 55 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden in einem Hybridisierungsinkubator. Fahren Sie als Nächstes mit dem Entfernen der Sonde fort. Beginnen Sie mit dem Entfernen des Hybridisierungspuffers, der Sonden enthält, und fügen Sie dann einen Waschpuffer hinzu.
Waschen Sie die Proben zweimal mit Waschpuffer für 15 Minuten bei 55 Grad Celsius. Waschpuffer eins entfernen und Waschpuffer zwei hinzufügen. Waschen Sie die Proben mit Waschpuffer zweimal für 15 Minuten bei 55 Grad Celsius.
Waschpuffer zwei entfernen und dann 2X SSC hinzufügen. Waschen Sie die Proben zweimal mit 2X SSC für 15 Minuten bei 55 Grad Celsius. Entfernen Sie 2X SSC und fügen Sie dann vorgewärmtes PBST hinzu.
Waschen Sie die Proben 15 Minuten lang mit PBST bei Raumtemperatur. Für die Inkubation von Anti-DIG-Antikörpern entfernen Sie zunächst PBST und fügen Sie dann 1% blockierenden Puffer hinzu. Inkubieren Sie die Proben für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur, während Sie langsam auf einer Wippe schütteln.
Entfernen Sie nach dem Blockieren den 1%-Blockierpuffer. Fügen Sie Anti-DIG-POD-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die DIG-markierte Sonde zu erkennen, entfernen Sie die Anti-DIG-POD-Lösung und fügen Sie Tris-Natriumchlorid-Tween-Puffer hinzu.
Waschen Sie die Proben dreimal für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Tris-Natriumchlorid-Tween-Puffer. Verdünnte fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Tyramid-Stammlösung im Amplifikationsverdünnungspuffer, um die aktive Cy5-Tyramidlösung herzustellen. Entfernen Sie so viel Tris-Natriumchlorid-Tween-Puffer wie möglich und fügen Sie dann die aktive Cy5-Tyramidlösung hinzu.
Inkubieren Sie die Proben für 10 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 10 Minuten im Dunkeln. Um den EdU-Detektionscocktail vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten.
Entfernen Sie PBST und fügen Sie dann den EdU-Erkennungscocktail hinzu. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln. Mit PBST dreimal für 10 Minuten im Dunkeln waschen.
Für die DNA-Färbung Hoechst in PBST verdünnen, um die Hoechst-Lösung herzustellen. Entfernen Sie die PBST-Lösung, und fügen Sie dann die Hoechst-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten im Dunkeln.
Waschen Sie die Proben drei- bis viermal mit PBST für 10 Minuten im Dunkeln. Als nächstes für die Montage die Medusen mit einer Transferpipette mit abgeschnittener Spitze auf die Bank auf dem Diaglas übertragen. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas mit einer Pinzette auf die Medusen und verschließen Sie die Seite des Deckglases mit klarem Nagellack.
Die Co-Markierung von Nanos1-Expression und EdU-positiven Zellen zeigte das räumliche Muster von stammartigen Zellen und proliferativen Zellen im Tentakel. EdU-positive Zellen waren weiter über den Tentakelkolben verteilt, während Nanos1-positive Zellen, die sich lokaler an der Tentakelbirne und der neuen Verzweigungsstelle ansammelten, darauf hindeuten, dass unterschiedliche Verteilungen von stammartigen Zellen und proliferierenden Zellen je nach Entwicklungszeitpunkt und verschiedenen Stadien nachgewiesen werden. Die Co-Markierung von EdU und Nanos1 wurde in 19,79% der Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine aktiv proliferierende Stammzellpopulation sind.
Interessanterweise wurden 14,46% der Zellen in der Mitte der Birne und an der neuen Verzweigungsstelle als EdU-positive Nanos1-negative Zellen gefunden, was auf das Vorhandensein von nicht-stammartigen proliferativen Zellen hindeutet. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass 26,32% der Zellen an der Basis der Birne und an der neuen Verzweigungsstelle EdU-negativ Nanos1-positiv waren, was auf das Vorhandensein einer Stammzellpopulation hinweist, die entweder langsam zyklisch oder ruhend ist, von denen keine durch EdU-Pulsmarkierung erkannt wird. Die EdU-Pulsmarkierung mit kurzer Inkubationszeit ermöglicht den Nachweis nur proliferativer Zellen zwischen stammähnlichen Zellen und nicht-stammähnlichen Zellen.
Wenn man die Inkubationszeit für EdU ändert und Langzeitjagdexperimente kombiniert, können langsam zyklische Stammzellen oder andere Zelltypen einschließlich Nachkommen und differenzierte Zellen markiert werden.
