Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。クラゲクラドネマの単一細胞レベルで幹細胞の分布を特定できます。同じクラゲサンプル中の幹細胞様細胞と増殖細胞を可視化することができ、増殖性幹細胞と非増殖性幹細胞の検出が可能となり、幹細胞の不均一性の理解につながります。
幹細胞を含む動物モデルを用いた発生生物学・再生研究ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、特別なシステムなしで実験室環境で維持できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは枝分かれした触手を持っています。
分岐は、触手の軸方向に沿った新しい部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端に向かって押し出されます。触手は切断後数日以内に再生することもできます。
サイズが小さく、取り扱いが簡単で、成体幹細胞または幹細胞様細胞が存在するため、クラドネーマはさまざまなプロセスにおける幹細胞の役割を調査するのに適したシステムです。まず、3.5ミリリットルのトランスファーピペットを使用してCladonema medusaeを1.5ミリリットルのチューブに入れ、ASWを最大500マイクロリットルまで加えます。7.5マイクロリットルの10ミリモルEdUストック溶液を加え、サンプルを摂氏22度で1時間インキュベートします。
1 時間待ってから、EdU を含む ASW をできるだけ多く削除します。メデューサを麻酔した後、5分間インキュベートします。ASWに4%パラホルムアルデヒドを入れて摂氏4度で一晩メデューサを固定します。
プロテイナーゼ処理および固定後、パラホルムアルデヒドを除去し、0.1%Tweenを含むPBSでサンプルを20回ずつ10分間洗浄します。PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファーを追加します。サンプルをハイブリダイゼーションバッファー中で室温で15分間インキュベートします。
ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新鮮なハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で少なくとも2時間摂氏55度でプレハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーと共にインキュベートします。
ハイブリダイゼーションインキュベーター内で摂氏55度で18〜24時間ハイブリダイズする。次に、プローブの取り外しに進みます。プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーを除去することから始め、次に洗浄バッファー1を追加します。
サンプルを洗浄バッファーで摂氏55度で15分間2回洗浄します。洗浄バッファー1を除去し、洗浄バッファー2を追加します。サンプルを洗浄バッファー2で摂氏55度で15分間2回洗浄します。
洗浄バッファー2を除去し、次に2X SSCを追加します。サンプルを2X SSCで摂氏55度で15分間2回洗浄します。2X SSCを取り外してから、予熱したPBSTを追加します。
サンプルを室温でPBSTで15分間洗浄します。抗DIG抗体のインキュベーションでは、まずPBSTを除去し、次に1%ブロッキングバッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、室温で少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。
ブロック後、1% ブロッキング バッファーを削除します。抗DIG-POD溶液を加え、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。DIG標識プローブを検出するには、抗DIG-POD溶液を除去し、トリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを追加します。
サンプルを塩化トリスナトリウムトゥイーンバッファーで室温で10分間3回洗浄します。蛍光色素結合チラミドストック溶液を増幅希釈バッファーで希釈し、活性型Cy5チラミド溶液を作ります。できるだけ多くのトリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを除去してから、活性Cy5チラミド溶液を追加します。
サンプルを暗所で10分間インキュベートします。サンプルをPBSTで暗所で10分間3回洗浄します。EdU検出カクテルを準備するには、成分を混合します。
PBSTを削除してから、EdU検出カクテルを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。暗所で10分間PBSTで3回洗います。
DNA染色の場合は、ヘキストをPBSTで希釈してヘキスト溶液を調製します。PBST を削除し、ヘキスト ソリューションを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。
サンプルをPBSTで3〜4回、暗所で10分間洗浄します。次に取り付けるために、先端を切り取ったトランスファーピペットを使用して、メデューサをスライドガラス上の土手に移します。鉗子でメデューサの上にカバーガラスをそっと置き、カバーガラスの側面を透明なマニキュアで密封します。
Nanos1発現とEdU陽性細胞の共標識により、触手内の幹細胞と増殖細胞の空間パターンが明らかになりました。EdU陽性細胞は触手球全体に広く分布し、Nanos1陽性細胞は触手球と新しい分岐部位に局所的に蓄積し、発生時期や病期によって幹細胞と増殖細胞の明確な分布が検出されることが示唆されました。EdUとNanos1の共標識は19.79%の細胞で観察され、これらの細胞が活発に増殖する幹細胞集団であることを示唆しています。
興味深いことに、細胞の14.46%が球根の中央と新しい分岐部位でEdU陽性のNanos1陰性であることが判明し、非幹様増殖細胞の存在を示唆しています。対照的に、26.32%の細胞が球根の基部と新しい分岐部位でEdU陰性のNanos1陽性であることが観察され、遅いサイクルまたは静止した幹細胞集団の存在を示しており、どちらもEdUパルス標識では検出されません。短いインキュベーション時間のEdUパルス標識により、幹細胞様細胞と非幹細胞様細胞のうち増殖細胞のみを検出することができます。
EdUのインキュベーション時間を変更し、長時間の追跡実験を組み合わせる場合、ゆっくりとしたサイクリング幹細胞または子孫および分化細胞を含む他の細胞タイプをマークすることができます。
