La tinción conjunta de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Podemos identificar la distribución de células madre a nivel de una sola célula en la medusa Cladonema. Podemos visualizar células madre y células proliferantes en la misma muestra de medusas, lo que permite la detección de células madre proliferantes y no proliferantes, lo que lleva a la comprensión de la heterogeneidad de las células madre.
Estudios de biología del desarrollo y regeneración utilizando modelos animales que incluyen células madre. La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin ningún sistema especializado. Cladonema medusae tiene tentáculos ramificados.
La ramificación ocurre en un nuevo sitio a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, y las ramas más viejas son empujadas hacia la punta. Los tentáculos también pueden regenerarse a los pocos días de la amputación.
El pequeño tamaño, el fácil manejo y la presencia de células madre adultas o células madre hacen de Cladonema un buen sistema para investigar el papel de las células madre en diferentes procesos. Para comenzar, coloque Cladonema medusae en tubos de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de transferencia de 3,5 mililitros y agregue ASW hasta un volumen total de 500 microlitros. Añadir 7,5 microlitros de solución madre de EdU 10 milimolares e incubar las muestras durante una hora a 22 grados centígrados.
Espere una hora y retire la mayor cantidad posible de ASW que contenga EdU. Después de anestesiar las medusas, incubar durante cinco minutos. Arregle las medusas durante la noche a cuatro grados centígrados con 4% de paraformaldehído en ASW.
Para el tratamiento con proteinasa y post-fijación, retire el paraformaldehído y lave las muestras con PBS que contiene 0,1% Tween 20 tres veces durante 10 minutos cada una. Elimine el PBST y agregue el búfer de hibridación. Incubar las muestras en el tampón de hibridación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Retire el búfer de hibridación y agregue el búfer de hibridación nuevo. Prehibridar a 55 grados centígrados durante al menos dos horas en una incubadora de hibridación. Retire el tampón de hibridación e incube con el tampón de hibridación que contiene las sondas.
Hibridar a 55 grados centígrados durante 18 a 24 horas en una incubadora de hibridación. A continuación, proceda con la extracción de la sonda. Comience con la eliminación del tampón de hibridación que contiene sondas y luego agregue el tampón de lavado uno.
Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Retire el tampón de lavado uno y agregue el tampón de lavado dos. Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados.
Retire el tampón de lavado dos y luego agregue 2X SSC. Lave las muestras con 2X SSC dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Elimine 2X SSC y luego agregue PBST precalentado.
Lave las muestras durante 15 minutos con PBST a temperatura ambiente. Para la incubación de anticuerpos anti-DIG, comience por eliminar PBST y luego agregue un tampón de bloqueo del 1%. Incubar las muestras durante al menos una hora a temperatura ambiente mientras agita lentamente un balancín.
Después del bloqueo, elimine el búfer de bloqueo del 1%. Agregue la solución anti-DIG-POD e incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Para detectar la sonda marcada con DIG, retire la solución anti-DIG-POD y agregue tampón Tween de cloruro de sodio trisódico.
Lave las muestras con tampón Tween de cloruro de sodio tris tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. Diluir la solución madre de tiramida conjugada con colorante fluorescente en el tampón diluyente de amplificación para producir la solución activa de tiramida Cy5. Retire la mayor cantidad posible de tampón Tween de cloruro de sodio de tris y, a continuación, agregue la solución activa de tiramida Cy5.
Incubar las muestras durante 10 minutos en la oscuridad. Lave las muestras con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes.
Elimine PBST y luego agregue el cóctel de detección EdU. Incubar la muestra en la oscuridad durante 30 minutos. Lavar con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad.
Para la tinción de ADN, diluir Hoechst en PBST para preparar la solución de Hoechst. Quite el PBST y, a continuación, agregue la solución Hoechst. Incubar las muestras durante 30 minutos en la oscuridad.
Lave las muestras con PBST de tres a cuatro veces durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, para el montaje, transfiera las medusas al banco en el vidrio deslizante usando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre las medusas con pinzas y selle el costado del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
El etiquetado conjunto de la expresión de Nanos1 y las células positivas de EdU reveló el patrón espacial de células madre y células proliferativas en el tentáculo. Las células positivas para EdU se distribuyeron más ampliamente por todo el bulbo del tentáculo, mientras que las células positivas para Nanos1 se acumularon más localmente en el bulbo del tentáculo y el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere que se detectan distintas distribuciones de células madre y células proliferantes dependiendo del momento del desarrollo y las diferentes etapas. El etiquetado conjunto de EdU y Nanos1 se observó en el 19,79% de las células, lo que sugiere que estas células son una población de células madre que prolifera activamente.
Curiosamente, se encontró que el 14,46% de las células eran Nanos1 negativas para EdU en el medio del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere la presencia de células proliferativas no similares al tallo. En contraste, se observó que el 26,32% de las células eran Nanos1 positivas para EdU negativas en la base del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que indica la presencia de una población de células madre que es de ciclo lento o inactiva, ninguna de las cuales se detecta mediante el etiquetado del pulso de EdU. El etiquetado de pulsos EdU con un tiempo de incubación corto permite la detección de solo células proliferativas entre células madre y células no similares a las células madre.
Al cambiar el tiempo de incubación de EdU y combinar experimentos de persecución a largo plazo, se pueden marcar células madre de ciclo lento u otros tipos de células, incluidas la progenie y las células diferenciadas.
