צביעה משותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. אנו יכולים לזהות התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד במדוזה Cladonema. אנו יכולים לדמיין תאים דמויי גזע ותאים מתרבים באותה דגימת מדוזות, המאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע מתרבים ולא מתרבים, מה שמוביל להבנת ההטרוגניות של תאי גזע.
ביולוגיה התפתחותית ומחקרי התחדשות באמצעות מודלים של בעלי חיים הכוללים תאי גזע. המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא כל מערכת מיוחדת. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות.
ההסתעפות מתרחשת באתר חדש לאורך הצד האדאקסיאלי של זרועות הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר ענפים ישנים יותר נדחקים החוצה לכיוון הקצה. זרועות הציד יכולות גם להתחדש תוך מספר ימים לאחר הקטיעה.
גודל קטן, טיפול קל ונוכחות של תאי גזע בוגרים או תאים דמויי גזע הופכים את Cladonema למערכת טובה לחקור את תפקידם של תאי גזע בתהליכים שונים. כדי להתחיל, מקם את Cladonema medusae לתוך צינורות 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה העברה של 3.5 מיליליטר והוסף ASW עד לנפח כולל של 500 מיקרוליטר. הוסיפו 7.5 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי EdU של 10 מילימולר ודגרו את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס.
המתן שעה והסר כמה שיותר ASW המכיל EdU. לאחר הרדמת המדוזה, לדגור במשך חמש דקות. תקן את המדוזה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם 4% פרפורמלדהיד ב- ASW.
לטיפול בפרוטאינאז ולאחר קיבוע, הסר את הפרפורמלדהיד ושטוף את הדגימות עם PBS המכיל 0.1% Tween 20 thrice במשך 10 דקות כל אחת. הסר את ה- PBST והוסף את מאגר ההכלאה. דגירה של הדגימות במאגר ההכלאה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את מאגר ההכלאה והוסף את מאגר ההכלאה החדש. טרום הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות באינקובטור הכלאה. הסר את מאגר ההכלאה ודגירה עם מאגר ההכלאה המכיל את הבדיקות.
הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות באינקובטור הכלאה. לאחר מכן, המשך בהסרת בדיקה. התחל עם הסרת מאגר ההכלאה המכיל בדיקות ולאחר מכן הוסף מאגר שטיפה אחד.
לשטוף את הדגימות עם מאגר לשטוף פעמיים במשך 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. הסר את מאגר הכביסה אחד והוסף את מאגר הכביסה שניים. שטפו את הדגימות במאגר פעמיים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
הסר את מאגר הכביסה 2 ולאחר מכן הוסף 2X SSC. לשטוף את הדגימות עם 2X SSC פעמיים במשך 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. הסר 2X SSC ולאחר מכן הוסף PBST שחומם מראש.
שטפו את הדגימות במשך 15 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר. עבור דגירה של נוגדנים נגד DIG, התחל על ידי הסרת PBST ולאחר מכן הוסף מאגר חוסם 1%. דגרו את הדגימות למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור איטי על נדנדה.
לאחר החסימה, הסר את המאגר החוסם 1%. הוסיפו תמיסת אנטי-DIG-POD ודגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לזהות את הבדיקה המסומנת ב- DIG, הסר את התמיסה נגד DIG-POD והוסף חיץ Tween של טריס נתרן כלורי.
שטפו את הדגימות עם חיץ Tween של טריס נתרן כלורי שלוש פעמים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. דילול תמיסת מלאי טירמיד מצומדת בצבע פלואורסצנטי במאגר המדולל של ההגברה כדי ליצור את תמיסת הטירמיד הפעילה Cy5. הסר כמה שיותר חיץ טריס נתרן כלורי Tween ולאחר מכן הוסף את תמיסת הטירמיד הפעילה Cy5.
לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בחושך. לשטוף את הדגימות עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות בחושך. כדי להכין את קוקטייל זיהוי EdU, מערבבים את הרכיבים.
הסר PBST ולאחר מכן הוסף את קוקטייל זיהוי EdU. לדגור את הדגימה בחושך במשך 30 דקות. יש לשטוף עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות בחושך.
לצביעת DNA, יש לדלל את Hoechst ב-PBST כדי להכין את תמיסת Hoechst. הסר את ה- PBST ולאחר מכן הוסף את פתרון Hoechst. דגירה של הדגימות במשך 30 דקות בחושך.
שטפו את הדגימות עם PBST שלוש עד ארבע פעמים למשך 10 דקות בחושך. הבא להרכבה, להעביר את medusae לבנק על זכוכית שקופית באמצעות פיפטה העברה עם קצה מנותק. יש להניח בעדינות כיסוי על המדוזה בעזרת מלקחיים ולאטום את צד הכיסוי עם לק שקוף.
התיוג המשותף של ביטוי Nanos1 ותאים חיוביים של EdU חשף את התבנית המרחבית של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים בזרוע. תאים חיוביים של EdU הופצו באופן נרחב יותר בכל נורת זרועות הציד, בעוד שתאים חיוביים של Nanos1 שהצטברו באופן מקומי יותר בנורת זרועות הציד ובאתר ההסתעפות החדש, מצביעים על כך שהתפלגויות שונות של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים מזוהות בהתאם לתזמון ההתפתחותי ולשלבים שונים. התיוג המשותף של EdU ו-Nanos1 נצפה ב-19.79% מהתאים, מה שמרמז על כך שתאים אלה הם אוכלוסיית תאי גזע המתרבה באופן פעיל.
באופן מסקרן, 14.46% מהתאים נמצאו כחיוביים ל-EdU Nanos1 שליליים במרכז הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמרמז על נוכחותם של תאים מתרבים שאינם דמויי גזע. לעומת זאת, 26.32% מהתאים נצפו כחיוביים ל-EdU שלילי Nanos1 בבסיס הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמעיד על נוכחות של אוכלוסיית תאי גזע שהיא מחזורית איטית או שקטה, שאף אחד מהם לא זוהה על ידי תיוג דופק EdU. תיוג דופק EdU עם זמן דגירה קצר מאפשר זיהוי של תאים מתרבים בלבד בקרב תאים דמויי גזע ותאים שאינם דמויי גזע.
כאשר משנים את זמן הדגירה עבור EdU ומשלבים ניסויי מרדף ארוכי שנים, ניתן לסמן תאי גזע בעלי מחזור איטי או סוגי תאים אחרים כולל צאצאים ותאים ממוינים.
