Fotokontrollü, biyolojik olarak aktif bileşikler, moleküllerinde geri dönüşümlü fotoizomerize edilebilir fragmanlar, fotoanahtarlar içerir. Bileşikler, geri dönüşümlü ışık kaynaklı elektrosiklik dönüşümlere maruz kalan bir diaryleten fragmanı tarafından modifiye edilmiş siklik peptitlerdir. Foto-anahtarlama yapabilirler, yani UV tarafından üretilen, biyolojik olarak aktif olmayan bir form ile kırmızı ışık üreten, biyolojik olarak aktif bir form arasında geçiş yapabilirler.
Fotoanahtarlanabilir ilaçların, fotoanahtarlanamayan ilaçlardan daha güvenli olduğuna inanılmaktadır. Bunun nedeni, toksik olmayan, devre dışı bırakılmış bir formu insan vücuduna uygulayabilmeniz ve yalnızca ihtiyacınız olan yerde, örneğin tümörler, burgular veya yaralar gibi ışıkla lokal olarak aktive edebilmenizdir. Bu tür fotofarmakoloji ilaçlarının klinik öncesi veya klinik gelişimi için standart bir yöntem veya protokol yoktur, bu nedenle burada size bu erken klinik öncesi araştırma için kullanılabilecek deneyler göstermek istiyoruz.
Kateryna Horbatok ve Tetiana Makhnii prosedürleri gösterecek. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Bienta Şirketi Biyoetik Komisyonu tarafından onaylandı. Standart prosedürleri kullanarak tamponları hazırlayarak başlayın.
Alternatif olarak, piyasada satılan çözümleri kullanın. Bileşiklerin stok çözeltilerini hazırlayın. Her bileşik için, halka kapalı fotoformdaki bileşiğin 5.12 miligramlık iki partisini, biri berrak diğeri siyah, şeffaf olmayan duvarlı iki adet 1.5 mililitrelik Eppendorf tüpüne tartın.
Pozitif bir kontrol olarak, ekstra bir tüp içinde, fotokontrollü olmayan, peptit, ebeveynin 2.28 miligramını tartın. Her numuneye 100 mikrolitre saf DMSO ekleyin ve 30 saniye boyunca vorteks yapın. Çözeltiyi 650 nanometre lazerle, santimetre kare başına 6 watt ışık gücü yoğunluğuyla, karıştırmayı sağlamak için vorteksleme ile ışınlayarak açık duvarlı tüpteki stok çözeltisini fotoizomerize edin.
Renk koyu mordan açık kahverengiye değişene kadar devam edin. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyun. Kuyu başına 5.000 ila 10.000 hücre tohumu.
Berrak bir tabana ve siyah, şeffaf olmayan duvarlara sahip 96 kuyucuklu steril bir plakanın merkezi 60 kuyucuğunda 200 mikrolitre DMEM'de yaklaşık 8.000 Lewis akciğer karsinomu hücresi kullandık. Kalan 36 kuyuyu saf DMEM ile doldurun. Plakaları gece boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, bileşiklerin seri seyreltilerini ve polipropilen otoklavlanmış şeffaf plakalarda pozitif kontrolü hazırlayın. DMSO'daki stoklarla başlayın ve DMEM ile seyreltin, ancak son en yüksek konsantrasyonda% 1 hacimli DMSO'yu aşmayın. İncelenen bileşiklerin kontrolsüz fotoizomerizasyonunu önlemek için, steril kabindeki ışıkları kapatın.
Seyreltmelerin 100 mikrolitresini, tipik olarak beş ila 150 mikromolar aralıkta, kuyucuklardaki bileşiklerin gerekli nihai konsantrasyonuna ulaşmak için 100 mikrolitre önceden eklenmiş DMEM ile 56 kuyucuğa aktarın. Daha sonra, negatif kontrol görevi gören dört kuyucuğa 100 mikrolitre DMEM ekleyin. Kontrolsüz foto geçişi önlemek için plakaları alüminyum folyo veya plastik, şeffaf olmayan bir kapakla örtün.
Plakaları, seçilen inkübasyon süresi için 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkalardan sonra, plakalara kuyucuk başına 50 mikrolitre boyama çözeltisi ekleyin. Bu deney için son boyama çözeltileri olarak beş mikromolar Hoechst 33342 ve bir mikromolar propidyum iyodür kullanın.
20 dakika boyunca 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin. 20X büyütme objektif lensi kullanarak otomatik floresan görüntüleme gerçekleştirin. Yöntemin bu kısmı için laboratuvar işlemleri, 2D deney için tarif edilenlerle aynıdır: hücre kültürünün hazırlanması, test edilen bileşiklerle inkübasyon ve görüntüleme.
Bununla birlikte, bu durumda, hücreler siyah, şeffaf olmayan duvarlara sahip 384 kuyulu, ultra düşük yapışmalı, U-dipli bir plakada kompakt, olgun sferoidler olarak hazırlanır. Bu büyüklükte bir plaka kullanmak, bir deneyde iki bileşiğin karşılaştırılmasına izin verir. Bu deneyde, çok renkli boyama çözeltisinin üçüncü bir bileşeni olarak kalsein'yi kullandık.
Hem 2D hem de 3D deneylerden elde edilen görüntüler, cihazların otomatik görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Hoechst ve propidium iyodür boyaları ile boyanmış hücreler nekrotik olarak ölü kabul edilir ve konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak fraksiyonları IC50 değerini hesaplamak için kullanılır. Örnek ışınlama için optik treni monte edin.
Lazer ışık kaynağından bir optik kablo, değişken odak uzaklığına sahip bir lens, şeffaf olmayan kapaklı bir şırınga ve düz bir kesim ucundan oluşur. Sonraki tüm işlemler, minimum işyeri aydınlatması ile karanlık bir odada yapılmalıdır. Aktif olmayan fotoformal bileşiklerle yüklü bir model doku örneği hazırlayın.
Tipik bir çalışmada, beş gram taze kıyılmış domuz eti, kilogram başına 50 miligramlık nihai konsantrasyona ulaşmak için bileşiğin PBS çözeltisi ile mekanik olarak karıştırılır. Şırıngayı yüklenen numune ile doldurun. Gerekli pozlama ve ışık dozaj süresi için numuneyi optik trende ışınlayın.
Maruz kaldıktan sonra, kütleyi pistonla şırıngadan iterek ve bir neşterle keserek numunenin dört milimetre kalınlığında dilimlerini yapın. Bileşiği bir asetonitril, su, TFA karışımı,% 70 asetonitril ve% 01 trifloroasetik asit ile 1.5 mililitrelik bir Eppendorf tüpünde tartın ve ekstrakte edin. Çözünmeyen malzemeyi çıkarmak ve süpernatanı toplamak için 20XG'de 30 dakika boyunca iki kez santrifüj yapın.
UV ile algılanan kromatogramları, kapalı formlarının 570 nanometre tespitinde ve halka açık formun 270 nanometre tespitinde kaydedin. Hücre deneylerinde stok çözeltilerine benzer şekilde hazırlanan ışınlanmamış ve ışınlanmış kontrol numunelerini kullanarak spesifik bekletme sürelerini belirleyin ve yöntemi kalibre edin. Deneyi üç kez tekrarlayın ve grafikteki her fotoformun normalleştirilmiş yüzdesini, ışınlanmış doku yüzeyinden uzaklığa karşı yüzdeyi çizin.
Sıfır gününde, her biri yaklaşık 20 gram ağırlığındaki C57 siyah 6 fareli yetişkin dişileri, sağ arka bacakta yaklaşık 100 mikrolitre DMEM ve Matrigel karışımında yaklaşık yarım milyon Lewis akciğer karsinomu hücresi süspansiyonu ile deri altından aşılayın. Bu prosedür% 5 izofluran sedasyon altında yapılır. Hayvanlar, tümörlerin palpe edilebildiği beş ila sekizinci günlerde tedaviye hazırdır.
Test edilmeyi içeren tüm işlemler yarı karanlık koşullar altında yapılmalıdır. Bu durum, bileşik dozu iki günlük bir süre boyunca aldıktan sonra hayvanları tedavi ederken de geçerlidir. Sekiz hayvandan oluşan dört grubu rastgele bir araya getirin ve kürkü tümör bölgesinden çıkarın.
İki kontrol grubu, aracın intravenöz enjeksiyonunu alır. 20 gramlık hayvan başına 100 mikrolitre salin ve iki deney grubundaki hayvanlar, test edilen bileşiği inaktif fotoformda mililitre salin başına bir miligramlık bir çözelti içinde aldılar. Bileşik bolusu kuyruk damarına kilo başına beş mililitrede uygulayın.
Bileşik enjekte edildikten iki saat 45 dakika sonra, santimetre kare başına 100 miliwatt'lık bir ışık gücü yoğunluğu kullanarak, 650 nanometre lazerle izofluran anestezisi altında tümör bölgesini 20 dakika boyunca ışınlayın. Önümüzdeki 30 dakika boyunca hayvanların koşullarını dikkatlice gözlemleyin. Hayvanları günlük olarak gözlemleyin ve ağırlıklarını ve tümörlerinin boyutlarını ölçün.
Tümör hacimlerini ölçün ve nekrozun ilerlemesini not edin. Standart prosedürü kullanarak hayatta kalma oranını belirleyin. 2D hücre kültürü deneyleri durumunda birinci adım için protokolümüzün sonuçları, burada LMB002 ile farklı konsantrasyonlarda ve inkübasyonun farklı dönemlerinde inkübe edilen Lewis akciğer karsinomu hücreleri için temsili bir görüntüde gösterildiği gibi görüntüler olarak sunulabilir.
Hoechst ve propidium iyodür ile boyanması, mavi kanaldaki hücre çekirdeklerinin görselleştirilmesine izin verir, böylece toplam hücre sayısı verilir. Kırmızı kanalda plazma zarının bütünlüğü bozulmuş hücreler gözlendi. İkincisinin nekrotik olarak öldüğü varsayılarak, incelenen bir bileşiğin görünür sitotoksisitesi, propidium iyodür-pozitif hücrelerin bir yüzdesi olarak ölçülebilir.
Otomatik görüntü analizi ile elde edilen veri niceliğinin sonuçları burada gösterilmektedir. LMB002 için, bileşik konsantrasyonundaki propidyum iyodür-pozitif hücrelerin yüzdesinin sigmoidal bağımlılıkları görülebilir. Bu verilerden IC50 değerleri belirlenebilir.
Deneyimiz, LMB002'nin açık formunun, prototip peptit Gramicidin S'den yaklaşık bir seyreltme adımı daha az toksik olduğunu, kapalı formun ise inkübasyon süresiyle artan üç ila dört seyreltme adımı daha düşük toksisite gösterdiğini ortaya koymuştur. 3D hücre deneyleri aynı tür ham verileri üretti, tek hücreli duvar başına bir tane sferoid görüntüleri çözdü. Kalseinin üçüncü bir boyama boyası olarak dahil edilmesi, yeşil kanalda gözlenen metabolik olarak aktif hücrelerin fraksiyonunun nicelleştirilmesini sağlar.
Doz etkisi eğrileri, 2D deneydekiler gibi, Z-yığını görüntü yığınlarından elde edildi. Panel A, 2B sonuçları doğrulayan bu eğrileri göstermektedir. Panel B'de gösterildiği gibi, genel sferoid çap bileşik konsantrasyonuna göre değişir.
İkinci adım için yapılan deney, UV ile algılanan, yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak her iki fotoformdaki LMB002 konsantrasyonlarının belirlenmesine izin verir. Her iki fotoform da tutma süreleri ve absorbans bakımından yeterince farklıydı ve şeklin A ve B panellerine entegre olarak gösterildi. Elde edilen veriler şekilde özetlenmiştir ve kırmızı ışık kaynağımızın, doku vekilinde bir santimetreye kadar derinlikte halka kapalı LMB002 fotodönüşümünü, santimetre kare başına yaklaşık 103 miliwatt'ta kıyılmış eti indüklediğini doğrulamaktadır.
Metodolojimizin üçüncü adımı olan in vivo deneyin sonuçları, Kaplan-Meier sağkalım eğrilerinde zamanın bir fonksiyonu olarak tümör büyümesini gösteren grafiklerle temsil edildi. Fotoanahtarlanabilir ilaç adaylarını değerlendirmek için burada temsil edilen strateji, diaryleten tipi fotoanahtarlara sahip bileşikler için pratik ve uygundur. Birinci adım, sitotoksisite miktarı, fotokontrollü bileşiklerin kütüphanelerinin ilk taraması için kullanılabilir.
İkinci adım, fotoanahtarlama verimliliği değerlendirmesi hem kurulumu kolay hem de etiktir. Canlı hayvanlar gerektirmez. Üçüncü adım, in vivo fotofarmakoloji modelleri, terapi küçük hayvanlara uygulanabilir.
