Etiketsiz özelliği, yüksek kimyasal özgüllüğü ve hücre altı çözünürlüğü ile yeni bir görüntüleme tekniği sergiliyoruz. Metodolojimiz, yaşlanmada metabolik işlev bozukluğu ve kanser gibi hastalıklarla ilgili soruları yanıtlayabilir Raman görüntüleme, iki foton floresan ve ikinci harmonik üretimi ile birleştiğinde, minimum numune hazırlığı gerektiren ve hücre örneğine zarar vermeden yüksek hücre altı çözünürlük elde eden, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme teknolojisi sunar. Platformumuzun bir parçası olarak çeşitli görüntüleme yöntemleri çalıştırılmaktadır.
Bireyler, sistemimizin ev yapımı olduğunu belirterek protokolümüzü ellerinden gelen en iyi şekilde takip etmelidir. Yol boyunca başarıyı sağlamak için kendi uygulamalarını geliştirmelidirler. İki ayrı tüpte, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 miligram DMEM tozunu 4.7 mililitre çift damıtılmış su ile ölçüp karıştırarak başlayın.
Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Her iki tüp için, tüpü girdaplamadan ve ters çevirmeden önce 4.7 mL döteryum oksit, 0.5 mL FBS ve 0.1 mL penisilin ve streptomisin ekleyin. Daha sonra, bir tüpe fazla fenilalanin ve ikinci tüpe fazla triptofan tozu ekleyin ve tekrar karıştırın.
Her iki tüpe sırasıyla mL başına 30 ve 95 mg metiyonin ve treonin ekleyin, ardından tüpü girdaplayın ve ters çevirin. Daha sonra, hazırlanan ortamı 0.22 mikrometre filtreli 25 milimetrelik bir şırınga filtresi ile filtreleyin. Konik tüpler içeren tüm ortamları Parafilm ile kapatın.
Hazırlanan medyayı dört santigrat derecede saklayın. %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş standart DMEM kullanarak şifacı hücreleri bir kültür şişesinde tutun. Şifacı hücreleri% 80 veya daha yüksek hücre canlılığına ulaşana kadar bir ila 10 arasında bir bölünme oranında alt kültürleyin.
Hücreleri tohumlamadan önce, sterilize edilmiş Poli-D-Lizin, laminin kaplı, yuvarlak 12 mm çaplı örtü astarlarını %70 Etanole batırın. Tüy bırakmayan mendiller kullanarak kapak fişlerini kurutun ve temiz kapak fişlerini plakanın uygun kuyularına yerleştirin. Hücreleri bir kez magnezyum ve kalsiyum iyonları olmadan PBS ile yıkayın.
Yapışma hücrelerini şişeden ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra hücrelere %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş DMEM ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücreleri, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyerek toplayın. Daha sonra,% 0.5 FBS ve% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Işık mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak tripan mavisi leke hücrelerini sayın ve 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlayın.
Plakayı hafifçe sallayarak hücreleri eşit olarak dağıtın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Sekiz saat sonra, eski kültür ortamını %50 döteryum oksit ve fazla fenilalanin veya %50 döteryum oksit ve fazla triptofan ortamı ile değiştirin.
Hücreleri 36 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre geri koyun. Şimdi dokuz mm çapında görüntüleme boşlukları olan mikroskop slaytları hazırlayın. Kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 15 mikrolitre PBS yerleştirin ve hücreleri aynı çözelti ile durulayın.
0,5 mL %4 metanol içermeyen paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve plakayı biyogüvenlik başlığının altında 15 dakika bekletin. Paraformaldehit çözeltisini aspire edin ve iki kez kalsiyum ve magnezyum demir ile takviye edilmiş PBS ile durulayın. Her oyuğa kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş bir mL PBS ekleyin.
Kapak fişlerini her bir kuyudan dikkatlice çıkarmak için steril cımbız kullanın. Bunları ters çevirin ve hücreyi içeren tarafı PBS ile temas eden görüntüleme boşluklarına yerleştirin. Şeffaf oje kullanarak kapak kaymasının dış katmanını görüntüleme ara parçasıyla kapatın.
Biyolojik numuneyi doğrudan objektif merceğin altındaki numune tutucuya yükleyin. Ardından, video kamerayı açmak için yazılımdaki kamera simgesine tıklayın ve 50X objektif lens ile ilgilenilen bir bölgeyi belirlemek için odak düzlemini ayarlayın. 100X objektif lense geçin.
Video kamerayı kapatmak için durdur simgesine tıklayın. Ardından mm başına 1.800 satırlık bir ızgara seçin ve toplama aralığını 400 ila 3.150 santimetre ters olarak ayarlayın. Son olarak, en az gürültü ve en doğru spektrum için alım süresini 90 saniyeye, birikimi üçe ve gruplamayı dörde ayarlayın.
Lazeri ısıtmak için başlat'a tıklayın. IX3CBH kontrol kutusunun ana şalterine ve ardından dokunmatik panel denetleyicisinin ana şalterine basarak başlayın. Ardından, ana lazer birleştirici FV31S tarağına bağlı LDOBIS6 lazer uzaktan kumanda için güç kaynağının AC adaptörünün ana anahtarını açın.
Ayrıca alt lazer birleştirici FV31S tarağına bağlı LDOBIS6 lazer uzaktan güç kaynağının AC adaptörünü açın. Bundan sonra, SI fotodiyot dedektörünün ana anahtarlarına basın ve amplifikatörü kilitleyin. Lazer IR'yi 1031 nanometreye ayarlayın Pico zümrüt sistemini 720 ila 990 nm arasında ayarlanabilir dalga boyuna ayarlayın.
Numuneyi yağın üzerine monte edin ve numunenin sabitlendiği mikroskop lamına büyük bir su damlası yerleştirin. Tarama boyutunu 512 x 512 piksel olarak seçin. Görüntüleri bir Olympus olarak alın ve kaydedin.
OIR grafik dosyası. Sinyali 862.0 olarak ayarladıktan sonra bir arka plan görüntüsü alın ve kaydedin. Bekleme süresini piksel başına sekiz mikrosaniyeye ve piksel boyutunu 512 x 512 piksele ayarlayın.
Lazer deklanşör gücü parametresini 150 miliwatt'a ayarlayın 3D görüntü rekonstrüksiyonu için, uyarılmış Raman kaybını 2.850 cm ters olarak ayarlayın. İstenen tek hücreler tanımlandıktan sonra, bu hücrelerin üst ve alt katmanlarını tespit etmek için üst odak düzleminden taramak için lazeri kaydedin. Döteryum oksit, problanmış, uyarılmış Raman saçılımı, CD sinyallerinin tek hücreler üzerindeki uzamsal dağılımını görselleştirmek için kullanıldı.
Kontrol hücreleri orta derecede CD, lipid ve protein bantları sergiledi. Bununla birlikte, 15 x v ve 15 x yolculuk, daha güçlü CD lipid ve protein yasakları sergiledi. Kantitatif analiz, aşırı aromatik amino asitlerin lipid sentezini %10 ila %17 oranında yukarı regüle edebileceğini, ancak protein sentezini %10 oranında azaltabileceğini gösterdi Aromatik amino asitlerle muamele edilen hücrelerin metrik analizi, flavin bölü flavinde %50'lik bir artış ve doymuş lipide bölünen doymamış lipitte %10'luk bir artış gösterdi.
Kontrol altındaki şifacı hücrelerde uyarılmış Raman 3D lipid damlacık hacmi projeksiyonu ve aşırı aromatik amino asit koşulları gösterilmiştir. 3D lipid damlacıklarının kantitatif analizleri, sayımlarda bir artış gösterdi, ancak aromatik amino asitlerle muamele edilen hücrelerde kontrole kıyasla boyutta bir azalma gösterdi. Raman ve iki foton floresan görüntüleme için görüntüleme parametreleri, en iyi görüntüleme kalitesini sağlamak için bir örnekten diğerine optimize edilmelidir.
Bireyler, yaşlanma ve hastalıklardaki erken metabolik değişiklikleri aydınlatan kollajen yapısını incelemek ve nörodejenerasyon veya kanserin ilerlemesini anlamak için sistemimizi ikinci harmonik nesil ile birleştirebilir. Teknolojimiz, biyolojik sistemlerde lipid ve protein sentezini yüksek hücre altı çözünürlüğü ile görselleştiren bu türden bir ilk. Teknoloji, invaziv olmayan hastalık tespiti için kliniğe de çevrilebilir.
