Nous présentons une nouvelle technique d’imagerie avec une capacité sans marqueur, une spécificité chimique élevée et une résolution subcellulaire. Notre méthodologie peut répondre à une question sur le dysfonctionnement métabolique dans le vieillissement et des maladies telles que le cancer L’imagerie Raman, couplée à la fluorescence de deux photons et à la deuxième génération harmonique, offre une technologie d’imagerie non destructive et sans marquage qui nécessite une préparation minimale de l’échantillon et atteint une résolution subcellulaire élevée sans endommager l’échantillon cellulaire. Plusieurs modalités d’imagerie sont exploitées dans le cadre de notre plateforme.
Les individus doivent suivre notre protocole au mieux de leurs capacités, en notant que notre système est construit à la maison. En cours de route, ils devraient développer leur propre pratique pour assurer le succès. Dans deux tubes séparés, commencez par mesurer et mélanger 10 milligrammes de poudre DMEM avec 4,7 millilitres d’eau distillée double dans un tube conique de 15 mL.
Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Pour les deux tubes, ajoutez 4,7 mL d’oxyde de deutérium, 0,5 mL de FBS et 0,1 mL de pénicilline et de streptomycine avant de vortex et d’inverser le tube. Ensuite, ajoutez l’excès de phénylalanine dans un tube et l’excès de poudre de tryptophane dans le deuxième tube et mélangez à nouveau.
Ajouter de la méthionine et de la thréonine à 30 et 95 mg par mL, respectivement, dans les deux tubes, puis en tourbillonnant et en inversant le tube. Ensuite, filtrez le média préparé avec un filtre à seringue de 25 millimètres avec des filtres de 0,22 micromètre. Scellez tous les supports contenus dans des tubes coniques avec Parafilm.
Conservez les supports préparés à quatre degrés Celsius. Maintenir les cellules cicatrisantes dans un flacon de culture en utilisant du DMEM standard complété par 10% FBS, 1% de pénicilline et streptomycine. Sous-culture des cellules guérisseuses à un rapport fractionné de un à 10 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% ou plus de viabilité cellulaire.
Avant d’ensemencer les cellules, immergez le couvercle de poly-D-lysine stérilisé, enduit de laminine, rond de 12 mm de diamètre glissé dans de l’éthanol à 70%. Sécher les lamelles de couvercle à l’aide de lingettes non pelucheuses et placer les lamelles de couverture propres dans les puits appropriés de la plaque. Lavez les cellules une fois avec du PBS sans ions magnésium et calcium.
Ajouter 0,25% de trypsine pour dissocier les cellules d’adhérence du ballon et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez DMEM complété avec 10% FBS, 1% pénicilline et streptomycine aux cellules. Pipeter doucement de haut en bas.
Recueillir les cellules par centrifugation à 300 G pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, re-suspendre les cellules dans DMEM complété avec 0,5% FBS et 1% pénicilline et streptomycine. Compter les cellules colorées au bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre au microscope optique et semer à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par puits d’une plaque de 24 puits.
Répartir les cellules uniformément en secouant doucement la plaque. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après huit heures, remplacez les anciens milieux de culture par 50% d’oxyde de deutérium et excès de phénylalanine ou 50% d’oxyde de deutérium et excès de tryptophane.
Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 36 heures. Préparez maintenant des lames de microscope avec des espaces d’imagerie de neuf mm de diamètre. Placez 15 microlitres de PBS, complétés par des ions calcium et magnésium et rincez les cellules avec la même solution.
Ajouter 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde sans méthanol à 4 % et laisser la plaque sous la hotte de biosécurité pendant 15 minutes. Aspirez la solution de paraformaldéhyde et rincez-la deux fois avec du PBS, complété deux fois par du calcium et du magnésium. Ajouter un mL de PBS, complété par des ions calcium et magnésium à chaque puits.
Utilisez une pince à épiler stérile pour retirer soigneusement les bordereaux de couvercle de chaque puits. Inversez-les et placez le côté contenant la cellule sur les espaces d’imagerie en contact avec le PBS. Scellez la couche externe du couvercle avec l’entretoise d’imagerie à l’aide de vernis à ongles transparent.
Chargez l’échantillon biologique sur le porte-échantillon directement sous la lentille de l’objectif. Cliquez ensuite sur l’icône de la caméra sur le logiciel pour allumer la caméra vidéo et ajuster le plan de mise au point pour identifier une région d’intérêt avec l’objectif 50X. Passez à l’objectif 100X.
Cliquez sur l’icône d’arrêt pour éteindre la caméra vidéo. Sélectionnez ensuite un réseau de 1 800 lignes par mm et définissez la plage d’acquisition de 400 à 3, 150 centimètres inverse. Enfin, réglez le temps d’acquisition à 90 secondes, l’accumulation à trois et le classement à quatre pour le moins de bruit et le spectre le plus précis.
Cliquez sur Démarrer pour réchauffer le laser. Commencez par appuyer sur l’interrupteur principal du boîtier de commande IX3CBH sur On, puis sur l’interrupteur principal du contrôleur à écran tactile. Allumez ensuite l’interrupteur principal de l’adaptateur secteur de l’alimentation pour LDOBIS6 télécommande laser connectée au comb principal du combinateur laser FV31S.
Allumez également l’adaptateur secteur de l’alimentation à distance laser LDOBIS6 connectée au peigne FV31S du combinateur sous-laser. Après cela, appuyez sur les interrupteurs principaux du détecteur de photodiodes SI et de l’amplificateur de verrouillage. Réglez l’IR laser à 1031 nanomètres Réglez le système d’émeraude pico à une longueur d’onde accordable comprise entre 720 et 990 nm.
Montez l’échantillon sur l’huile et placez une grosse gouttelette d’eau sur la lame de microscope où l’échantillon est fixé. Sélectionnez la taille de numérisation comme 512 x 512 pixels. Acquérir et enregistrer les images en tant qu’Olympus.
Fichier graphique OIR. Après avoir réglé le signal sur 862.0, acquérez une image d’arrière-plan et enregistrez-la. Ajustez le temps d’arrêt à huit microsecondes par pixel et la taille des pixels à 512 x 512 pixels.
Réglez le paramètre de puissance de l’obturateur laser sur 150 milliwatts Pour la reconstruction d’images 3D, réglez la perte Raman stimulée à 2 850 cm inversement. Une fois que les cellules individuelles souhaitées ont été identifiées, enregistrez le laser pour balayer à partir du plan de mise au point supérieur afin de détecter les couches supérieure et inférieure de ces cellules. L’oxyde de deutérium, sondé et stimulé par diffusion Raman a été utilisé pour visualiser la distribution spatiale des signaux CD sur des cellules individuelles.
Les cellules témoins présentaient des bandes CD, lipidiques et protéiques modérées. Cependant, le trip 15 x v et 15 x a montré des interdictions plus fortes de lipides et de protéines CD. L’analyse quantitative a indiqué que l’excès d’acides aminés aromatiques peut réguler à la hausse la synthèse des lipides de 10 à 17%, mais à la baisse la synthèse des protéines de 10%L’analyse métrique des acides aminés aromatiques des cellules traitées a montré une augmentation de 50% de la flavine divisée par la flavine plus NADH et une augmentation de 10% des lipides insaturés divisée par les lipides saturés.
La projection stimulée du volume de gouttelettes lipidiques Raman 3D dans les cellules guérisseuses sous contrôle et les conditions d’excès d’acides aminés aromatiques sont montrées. Les analyses quantitatives des gouttelettes lipidiques 3D ont montré une augmentation des numérations, mais une réduction de la taille des cellules traitées aux acides aminés aromatiques par rapport au contrôle. Les paramètres d’imagerie pour l’imagerie Raman et l’imagerie fluorescente à deux photons doivent être optimisés d’un échantillon à l’autre pour assurer la meilleure qualité d’image.
Les individus peuvent coupler notre système avec une deuxième génération d’harmoniques pour étudier la structure du collagène, qui élucide les changements métaboliques précoces dans le vieillissement et les maladies, et comprendre la progression de la neurodégénérescence ou du cancer. Notre technologie est la première de ce genre à visualiser la synthèse des lipides et des protéines dans des systèmes biologiques à haute résolution subcellulaire. La technologie peut également être traduite en clinique pour la détection non invasive des maladies.
