Presentiamo una nuova tecnica di imaging con capacità label-free, elevata specificità chimica e risoluzione subcellulare. La nostra metodologia può rispondere a domande sulla disfunzione metabolica nell'invecchiamento e malattie come il cancro L'imaging Raman, accoppiato con la fluorescenza a due fotoni e la generazione di seconda armonica, offre una tecnologia di imaging non distruttiva e senza etichetta che richiede una preparazione minima del campione e raggiunge un'elevata risoluzione subcellulare senza danneggiare il campione cellulare. Diverse modalità di imaging sono gestite come parte della nostra piattaforma.
Gli individui dovrebbero seguire il nostro protocollo al meglio delle loro capacità, notando che il nostro sistema è costruito in casa. Lungo la strada dovrebbero sviluppare la propria pratica per garantire il successo. In due tubi separati iniziare misurando e mescolando 10 milligrammi di polvere DMEM con 4,7 millilitri di acqua distillata doppia in un tubo conico da 15 ml.
Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Per entrambi i tubi, aggiungere 4,7 ml di ossido di deuterio, 0,5 ml di FBS e 0,1 ml di penicillina e streptomicina prima di vorticare e invertire il tubo. Quindi, aggiungere la fenilalanina in eccesso a un tubo e la polvere di triptofano in eccesso al secondo tubo e mescolare di nuovo.
Aggiungere metionina e treonina a 30 e 95 mg per ml, rispettivamente, a entrambi i tubi, seguito da vortice e capovolgere il tubo. Successivamente, filtrare il mezzo preparato con un filtro a siringa da 25 millimetri con filtri da 0,22 micrometri. Sigillare tutti i supporti contenuti tubi conici con Parafilm.
Conservare i supporti preparati a quattro gradi Celsius. Mantenere le cellule guaritrici in un pallone di coltura utilizzando DMEM standard integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina. Subcoltura le cellule guaritrici con un rapporto di divisione di uno a 10 fino a raggiungere l'80% o superiore di vitalità cellulare.
Prima di seminare le cellule, immergere la poli-D-lisina sterilizzata, rivestita di laminina, rotonda 12 mm di diametro scivola in 70% etanolo. Asciugare i vetrini di copertura utilizzando salviette prive di lanugine e posizionare i vetrini di copertura puliti negli appositi pozzetti della piastra. Lavare le cellule una volta con PBS senza ioni di magnesio e calcio.
Aggiungere lo 0,25% di tripsina per dissociare le cellule di aderenza dal pallone e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre minuti. Quindi aggiungere DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina alle cellule. Pipetta delicatamente su e giù.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, ri-sospendere le cellule in DMEM integrato con 0,5% FBS e 1% penicillina e streptomicina. Contare le cellule della colorazione blu tripano usando un emocitometro al microscopio ottico e seminare a una densità di due volte 10 alle quinte cellule per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
Distribuire uniformemente le cellule agitando delicatamente la piastra. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo otto ore, sostituire i vecchi terreni di coltura con il 50% di ossido di deuterio e l'eccesso di fenilalanina o il 50% di ossido di deuterio e mezzi di triptofano in eccesso.
Restituire le cellule all'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 36 ore. Ora prepara vetrini da microscopio con spazi di imaging di nove mm di diametro. Posizionare 15 microlitri di PBS, integrati con ioni di calcio e magnesio e risciacquare le cellule con la stessa soluzione.
Aggiungere 0,5 ml di soluzione paraformaldeide priva di metanolo al 4% e lasciare la piastra sotto il cappuccio di biosicurezza per 15 minuti. Aspirare la soluzione di paraformaldeide e risciacquarla con PBS, integrata con calcio e magnesio ferro due volte. Aggiungere un mL di PBS, integrato con ioni di calcio e magnesio a ciascun pozzetto.
Utilizzare pinzette sterili per rimuovere con cura i vetrini di copertura da ciascun pozzetto. Capovolgerli e posizionare la cella contenente il lato sugli spazi di imaging a contatto con il PBS. Sigillare lo strato esterno del vetrino con il distanziatore di imaging utilizzando uno smalto trasparente.
Caricare il campione biologico sul supporto del campione direttamente sotto la lente dell'obiettivo. Quindi fare clic sull'icona della fotocamera sul software per accendere la videocamera e regolare il piano di messa a fuoco per identificare una regione di interesse con l'obiettivo 50X. Passare all'obiettivo 100X.
Fare clic sull'icona di arresto per spegnere la videocamera. Quindi selezionare un reticolo di 1.800 linee per mm e impostare l'intervallo di acquisizione da 400 a 3.150 centimetri inverso. Infine, impostare il tempo di acquisizione a 90 secondi l'accumulo a tre e il binning a quattro per il minor rumore e lo spettro più accurato.
Fare clic su Start per riscaldare il laser. Iniziare premendo l'interruttore principale della scatola di controllo IX3CBH su On, quindi dall'interruttore principale del controller del pannello a sfioramento. Quindi accendere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LDOBIS6 telecomando laser collegato al pettine principale del combinatore laser FV31S.
Accendere anche l'adattatore CA del LDOBIS6 alimentatore remoto laser collegato al pettine sub laser combinatore FV31S. Successivamente, premere gli interruttori principali del rilevatore di fotodiodi SI e dell'amplificatore di blocco acceso. Impostare l'IR laser a 1031 nanometri Impostare il sistema pico emerald a una lunghezza d'onda regolabile tra 720 e 990 nm.
Montare il campione sull'olio e posizionare una grande goccia d'acqua sul vetrino del microscopio dove è fissato il campione. Selezionare la dimensione di scansione come 512 x 512 pixel. Acquisisci e salva le immagini come Olympus.
File grafico OIR. Dopo aver impostato il segnale su 862.0, acquisire un'immagine di sfondo e salvarla. Regolate il tempo di permanenza su otto microsecondi per pixel e la dimensione in pixel su 512x512 pixel.
Impostare il parametro di potenza dell'otturatore laser su 150 milliwatt Per la ricostruzione dell'immagine 3D, sintonizzare la perdita Raman stimolata su 2.850 cm inversa. Una volta identificate le singole cellule desiderate, registrare il laser per eseguire la scansione dal piano di messa a fuoco superiore per rilevare gli strati superiore e inferiore di tali cellule. L'ossido di deuterio, sondato, stimolato dallo scattering Raman è stato utilizzato per visualizzare la distribuzione spaziale dei segnali CD su singole cellule.
Le cellule di controllo mostravano bande CD, lipidiche e proteiche moderate. Tuttavia, il viaggio 15 x v e 15 x ha mostrato divieti lipidici e proteici CD più forti. L'analisi quantitativa ha indicato che l'eccesso di aminoacidi aromatici può sovraregolare la sintesi lipidica dal 10 al 17%, ma downregolare la sintesi proteica del 10%L'analisi metrica del rapporto delle cellule trattate con aminoacidi aromatici ha mostrato un aumento del 50% della flavina divisa per flavina più NADH e un aumento del 10% dei lipidi insaturi diviso per i lipidi saturi.
Vengono mostrate la proiezione del volume delle goccioline lipidiche Raman 3D stimolata nelle cellule guaritrici sotto controllo e le condizioni di eccesso di aminoacidi aromatici. Le analisi quantitative delle goccioline lipidiche 3D hanno mostrato un aumento della contea, ma una riduzione delle dimensioni delle cellule trattate con aminoacidi aromatici rispetto al controllo. I parametri di imaging per l'imaging Raman e l'imaging fluorescente a due fotoni devono essere ottimizzati da un campione all'altro per garantire la migliore qualità di immagine.
Gli individui possono accoppiare il nostro sistema con la seconda generazione armonica per studiare la struttura del collagene, che chiarisce i primi cambiamenti metabolici nell'invecchiamento e nelle malattie e comprendere la progressione della neurodegenerazione o del cancro. La nostra tecnologia è la prima di questo tipo a visualizzare la sintesi lipidica e proteica in sistemi biologici ad alta risoluzione subcellulare. La tecnologia può anche essere tradotta in clinica per il rilevamento di malattie non invasive.
