ラベルフリー機能、高い化学的特異性、および細胞内分解能を備えた新しいイメージング技術を紹介します。私たちの方法論は、老化や癌などの疾患における代謝機能障害に関する質問に答えることができます ラマンイメージングは、2光子蛍光と第2高調波発生と組み合わせて、最小限のサンプル調製で済み、細胞サンプルに損傷を与えることなく高い細胞内分解能を達成する非破壊でラベルフリーのイメージング技術を提供します。いくつかのイメージングモダリティは、当社のプラットフォームの一部として運用されています。
個人は、私たちのシステムが自家製であることに注意して、可能な限り私たちのプロトコルに従う必要があります。その過程で、彼らは成功を確実にするために彼ら自身の実践を開発するべきです。2つの別々のチューブで、15 mLのコニカルチューブ内で10ミリグラムのDMEM粉末と4.7ミリリットルの二重蒸留水を測定して混合することから始めます。
チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。両方のチューブに、チューブをボルテックスして反転させる前に、4.7 mLの酸化重水素、0.5 mLのFBS、および0.1 mLのペニシリンとストレプトマイシンを追加します。次に、1つのチューブに過剰なフェニルアラニンを追加し、2番目のチューブに過剰なトリプトファン粉末を加えて、再度混合します。
メチオニンとスレオニンをそれぞれ30 mg/mLと95 mgで両方のチューブに加え、続いてチューブをボルテックスして反転させます。その後、調製した培地を0.22マイクロメートルのフィルターを備えた25ミリメートルのシリンジフィルターでろ過します。円錐管を含むすべてのメディアをパラフィルムで密封します。
準備した培地は摂氏4度で保管してください。10%FBS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した標準DMEMを使用して、培養フラスコ内でヒーラー細胞を維持します。80%以上の細胞生存率に達するまで、1対10の分割比でヒーラー細胞を継代培養します。
細胞を播種する前に、滅菌したポリ-D-リジン、ラミニンコーティングされた直径12 mmの丸いカバースリップを70%エタノールに浸しました。糸くずの出ないワイプを使用してカバースリップを乾かし、きれいなカバースリップをプレートの適切なウェルに入れます。マグネシウムイオンとカルシウムイオンを含まないPBSで細胞を一度洗浄します。
0.25%トリプシンを加えて接着細胞をフラスコから解離させ、摂氏37度、5%二酸化炭素で3分間インキュベートします。次に、10%FBS、1%ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEMを細胞に追加します。ゆっくりと上下にピペットで動かします。
室温で3分間300Gで遠心分離することにより細胞を収集します。次に、0.5%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEMに細胞を再懸濁する。光学顕微鏡下で血球計算盤を用いてトリパンブルー染色細胞を計数し、24穴プレートのウェルあたり5番目の細胞に10倍の2倍の密度で播種した。
プレートを軽く振って細胞を均等に分配します。摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベートします。8時間後、古い培地を50%の酸化重水素と過剰のフェニルアラニンまたは50%の酸化重水素と過剰なトリプトファン培地と交換します。
細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で36時間インキュベーターに戻します。次に、直径9mmのイメージングスペースを備えた顕微鏡スライドを準備します。カルシウムイオンとマグネシウムイオンを補給した15マイクロリットルのPBSを入れ、同じ溶液で細胞をすすぎます。
4%メタノールフリーのパラホルムアルデヒド溶液を0.5 mL加え、プレートをバイオセーフティフードの下に15分間放置します。パラホルムアルデヒド溶液を吸引し、カルシウムとマグネシウム鉄を2回補給したPBSですすいでください。カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1mLのPBSを各ウェルに加えます。
滅菌ピンセットを使用して、各ウェルからカバースリップを慎重に取り外します。それらを反転させ、PBSと接触しているイメージングスペースにセル含有側を配置します。透明なマニキュアを使用して、イメージングスペーサーでカバースリップの外層をシールします。
生体試料を対物レンズの真下のサンプルホルダーに装填します。次に、ソフトウェアのカメラアイコンをクリックしてビデオカメラの電源を入れ、フォーカス面を調整して50倍対物レンズで関心領域を識別します。100倍の対物レンズに切り替えます。
停止アイコンをクリックして、ビデオカメラの電源を切ります。次に、1 mm あたり 1 , 800 行の格子を選択し、取得範囲を 400 から 3, 150 センチメートルの逆に設定します。最後に、アクイジション時間を90秒、累積時間を3秒、ビニングを4秒に設定して、ノイズを最小限に抑え、スペクトルを最も正確にします。
開始をクリックしてレーザーをウォームアップします。コントロールボックスIX3CBHのメインスイッチをオンにしてから、タッチパネルコントローラーのメインスイッチを押すことから始めます。次に、メインレーザーコンバイナーFV31Sコームに接続されたレーザーリモコンの電源LDOBIS6 ACアダプターのメインスイッチをオンにします。
また、サブレーザーコンバイナーFV31Sコームに接続されているLDOBIS6レーザーリモート電源のACアダプターをオンにします。その後、SIフォトダイオード検出器のメインスイッチとロックインアンプをオンにします。レーザーIRを1031ナノメートルに設定します ピコエメラルドシステムを720〜990nmの調整可能な波長に設定します。
サンプルをオイルにマウントし、サンプルが固定されている顕微鏡スライドに大きな水滴を置きます。[スキャン サイズ] を [512 x 512 ピクセル] として選択します。画像を取得してオリンパスとして保存します。
OIR グラフィック ファイル。信号を862.0に設定した後、背景画像を取得して保存します。滞留時間をピクセルあたり 8 マイクロ秒に、ピクセル サイズを 512 x 512 ピクセルに調整します。
レーザーシャッター出力パラメータを150ミリワットに設定します 3D画像再構成の場合は、誘導ラマン損失を2, 850 cm反転に調整します。目的の単一細胞が特定されたら、レーザーを登録して上焦点面からスキャンし、それらの細胞の最上層と最下層を検出します。酸化重水素、プローブ、誘導ラマン散乱を使用して、単一細胞上のCDシグナルの空間分布を視覚化しました。
対照細胞は、中程度のCD、脂質およびタンパク質バンドを示した。ただし、15 x vおよび15 xトリップでは、CD脂質とタンパク質の禁止が強くなりました。定量分析は、過剰な芳香族アミノ酸が脂質合成を10〜17%アップレギュレートする可能性があることを示しましたが、タンパク質合成を10%ダウンレギュレートする比率芳香族アミノ酸処理細胞のメトリック分析は、フラビンをフラビンとNADHで割ったフラビンが50%増加し、不飽和脂質が飽和脂質で割った値が10%増加したことを示しました。
制御下および過剰芳香族アミノ酸条件下での治療細胞における刺激ラマン3D脂肪滴体積投影が示されている。3D脂肪滴の定量分析では、カウントの増加が示されましたが、芳香族アミノ酸処理細胞では対照と比較してサイズが小さくなりました。ラマンおよび2光子蛍光イメージングのイメージングパラメータは、最高のイメージング品質を確保するために、1つのサンプルから次のサンプルに最適化する必要があります。
私たちのシステムを第2高調波発生と組み合わせることで、コラーゲン構造を研究し、老化や病気の初期の代謝変化を解明し、神経変性や癌の進行を理解することができます。私たちの技術は、生体系における脂質とタンパク質の合成を高い細胞内分解能で可視化するこの種の最初の技術です。この技術は、非侵襲的な疾患検出のためのクリニックにも変換できます。
