당사는 라벨 없는 기능, 높은 화학적 특이성 및 세포 내 분해능을 갖춘 새로운 이미징 기술을 선보입니다. 당사의 방법론은 노화 및 암과 같은 질병의 대사 기능 장애에 대한 질문에 답할 수 있습니다 라만 이미징은 2개의 광자 형광 및 2차 고조파 생성과 결합되어 최소한의 샘플 준비가 필요하고 세포 샘플을 손상시키지 않고 높은 세포 내 분해능을 달성하는 비파괴 및 비표지 이미징 기술을 제공합니다. 여러 이미징 양식이 당사 플랫폼의 일부로 운영됩니다.
개인은 최선을 다해 우리의 프로토콜을 따라야 하며, 우리 시스템은 집에서 구축된다는 점에 유의해야 합니다. 그 과정에서 그들은 성공을 보장하기 위해 자신의 관행을 개발해야 합니다. 두 개의 개별 튜브에서 15mL 원뿔형 튜브에서 10mg의 DMEM 분말과 4.7ml의 이중 증류수를 측정하고 혼합하는 것으로 시작합니다.
용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 두 튜브 모두에 산화중수소 4.7mL, FBS 0.5mL, 페니실린과 스트렙토마이신 0.1mL를 넣고 튜브를 볼텍싱하고 뒤집습니다. 다음으로, 과량의 페닐알라닌을 하나의 튜브에 첨가하고 과량의 트립토판 분말을 두 번째 관에 첨가하고 다시 혼합한다.
메티오닌과 트레오닌을 mL당 각각 30mg과 95mg으로 두 튜브에 넣은 다음 튜브를 볼텍싱하고 뒤집습니다. 그 후, 0.22 마이크로미터 필터가 있는 25mm 주사기 필터로 준비된 매체를 여과한다. 원뿔형 튜브가 포함된 모든 매체를 Parafilm으로 밀봉합니다.
준비된 배지를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 표준 DMEM을 사용하여 배양 플라스크에서 치유자 세포를 유지합니다. 치유 세포를 80% 이상의 세포 생존율에 도달할 때까지 1 대 10의 분할 비율로 계대배양한다.
세포를 파종하기 전에 멸균된 Poly-D-Lysine, 라미닌 코팅된 둥근 직경 12mm 커버 슬립을 70% 에탄올에 담그십시오. 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 커버 슬립을 말리고 깨끗한 커버 슬립을 플레이트의 적절한 웰에 넣습니다. 마그네슘과 칼슘 이온 없이 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
0.25% 트립신을 첨가하여 플라스크에서 부착 세포를 해리시키고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 세포에 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫을 펴 바릅니다.
실온에서 3분 동안 300 G에서 원심분리하여 세포를 수집한다. 다음으로, 0.5% FBS와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 세포를 다시 현탁합니다. 트립판 블루 염색 세포를 광학 현미경 하에서 혈구계를 사용하여 계수하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 5번째 세포를 10배의 밀도로 시딩하였다.
플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 8시간 후, 오래된 배양 배지를 50% 산화중수소 및 과량의 페닐알라닌 또는 50% 산화중수소 및 과잉 트립토판 배지로 교체합니다.
세포를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 36시간 동안 배양기로 되돌립니다. 이제 직경 9mm의 이미징 공간이 있는 현미경 슬라이드를 준비합니다. 칼슘과 마그네슘 이온이 보충 된 PBS 15 마이크로 리터를 넣고 동일한 용액으로 세포를 헹굽니다.
0.5 mL의 4 % 메탄올이없는 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하고 15 분 동안 생물 안전 후드 아래에 플레이트를 둡니다. 파라 포름 알데히드 용액을 흡인하고 PBS로 헹구고 칼슘과 마그네슘 철을 두 번 보충합니다. 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 PBS 1mL를 각 웰에 추가합니다.
멸균 핀셋을 사용하여 각 우물에서 덮개 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이를 반전시키고 PBS와 접촉하는 이미징 공간에 셀 포함 면을 놓습니다. 커버 슬립의 바깥층을 투명 매니큐어를 사용하여 이미징 스페이서로 밀봉합니다.
생물학적 샘플을 대물 렌즈 바로 아래에 있는 샘플 홀더에 로드합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 카메라 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 켜고 초점 평면을 조정하여 50X 대물 렌즈로 관심 영역을 식별합니다. 100X 대물 렌즈로 전환합니다.
중지 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 끕니다. 그런 다음 mm 당 1, 800 라인의 격자를 선택하고 획득 범위를 400에서 3, 150 센티미터 역으로 설정하십시오. 마지막으로, 노이즈를 최소화하고 스펙트럼을 가장 정확하게 측정하기 위해 획득 시간을 90초로, 누적을 3초로, 비닝을 4로 설정합니다.
시작을 클릭하여 레이저를 예열합니다. 먼저 컨트롤 박스 IX3CBH의 메인 스위치를 On으로 누른 다음 터치 패널 컨트롤러의 메인 스위치를 누릅니다. 그런 다음 메인 레이저 결합기 FV31S 빗에 연결된 레이저 리모컨용 전원 공급 장치의 AC 어댑터 메인 스위치를 켭니다LDOBIS6.
또한 서브 레이저 결합기 FV31S 빗에 연결된 LDOBIS6 레이저 원격 전원 공급 장치의 AC 어댑터를 켭니다. 그런 다음 SI 포토다이오드 검출기의 메인 스위치를 누르고 락인앰프를 켭니다. 레이저 IR을 1031 나노미터로 설정 피코 에메랄드 시스템을 720 - 990 nm 사이의 조정 가능한 파장으로 설정합니다.
오일에 샘플을 장착하고 샘플이 고정된 현미경 슬라이드에 큰 물방울을 놓습니다. 스캔 크기를 512 x 512 픽셀로 선택합니다. 이미지를 획득하고 Olympus로 저장합니다.
OIR 그래픽 파일. 신호를 862.0으로 설정한 후 배경 이미지를 획득하고 저장합니다. 유지 시간을 픽셀당 8마이크로초로 조정하고 픽셀 크기를 512 x 512 픽셀로 조정합니다.
레이저 셔터 출력 매개변수를 150밀리와트로 설정 3D 이미지 재구성의 경우 자극된 라만 손실을 2, 850cm 역으로 조정합니다. 원하는 단일 세포가 식별되면 레이저를 등록하여 상단 초점 평면에서 스캔하여 해당 셀의 상단 및 하단 레이어를 감지합니다. 산화중수소, 탐침, 자극 라만 산란을 사용하여 단일 세포에서 CD 신호의 공간 분포를 시각화했습니다.
대조군 세포는 중간 정도의 CD, 지질 및 단백질 밴드를 나타냈다. 그러나, 15 x v 및 15 x 트립은 더 강한 CD 지질 및 단백질 금지를 나타냈다. 정량 분석에 따르면 과량의 방향족 아미노산은 지질 합성을 10-17%까지 상향 조절할 수 있지만 단백질 합성을 10%로 하향 조절할 수 있습니다.방향족 아미노산 처리된 세포의 비율 메트릭 분석은 플라빈과 NADH로 나누어진 플라빈의 50% 증가와 포화 지질로 나눈 불포화 지질의 10% 증가를 보여주었습니다.
대조군 및 과잉 방향족 아미노산 조건 하에서 치유 세포에서 자극된 라만 3D 지질 액적 부피 투영이 표시됩니다. 3D 지질 방울의 정량적 분석은 대조군에 비해 방향족 아미노산 처리된 세포에서 카운트가 증가했지만 크기가 감소한 것으로 나타났습니다. 라만 및 2개의 광자 형광 이미징에 대한 이미징 파라미터는 최상의 이미징 품질을 보장하기 위해 한 샘플에서 다음 샘플로 최적화되어야 합니다.
개인은 노화와 질병의 초기 대사 변화를 밝히고 신경 변성 또는 암의 진행을 이해하는 콜라겐 구조를 연구하기 위해 우리 시스템을 2 차 고조파 생성과 결합 할 수 있습니다. 당사의 기술은 높은 세포 내 분해능을 가진 생물학적 시스템에서 지질 및 단백질 합성을 시각화하는 최초의 기술입니다. 이 기술은 또한 비침습적 질병 감지를 위한 임상으로 번역될 수 있습니다.
