نعرض تقنية تصوير جديدة ذات قدرة خالية من الملصقات ، وخصوصية كيميائية عالية ، ودقة تحت خلوية. يمكن لمنهجيتنا الإجابة على أسئلة حول الخلل الأيضي في الشيخوخة وأمراض مثل السرطان يقدم تصوير رامان ، إلى جانب مضان الفوتون والجيل التوافقي الثاني ، تقنية تصوير غير مدمرة وخالية من الملصقات تتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة وتحقق دقة عالية تحت الخلية دون الإضرار بعينة الخلية. يتم تشغيل العديد من طرق التصوير كجزء من منصتنا.
يجب على الأفراد اتباع بروتوكولنا بأفضل ما لديهم من قدرات ، مع ملاحظة أن نظامنا مبني محليا. على طول الطريق يجب عليهم تطوير ممارساتهم الخاصة لضمان النجاح. في أنبوبين منفصلين ، ابدأ بقياس وخلط 10 ملليغرام من مسحوق DMEM مع 4.7 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. لكلا الأنبوبين ، أضف 4.7 مل من أكسيد الديوتيريوم ، و 0.5 مل من FBS ، و 0.1 مل من البنسلين والستربتومايسين قبل دوامة الأنبوب وقلبه. بعد ذلك ، أضف الفينيل ألانين الزائد إلى أنبوب واحد ومسحوق التربتوفان الزائد إلى الأنبوب الثاني واخلطه مرة أخرى.
أضف الميثيونين والثريونين بمعدل 30 و 95 مجم لكل مل ، على التوالي ، إلى كلا الأنبوبين ، متبوعا بدوامة وقلب الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتصفية الوسائط المعدة باستخدام مرشح حقنة 25 ملم مع مرشحات 0.22 ميكرومتر. ختم جميع الوسائط الواردة أنابيب مخروطية مع Parafilm.
تخزين الوسائط المعدة في أربع درجات مئوية. الحفاظ على خلايا المعالج في دورق مزرعة باستخدام DMEM القياسية مع 10٪ FBS ، 1٪ البنسلين والستربتومايسين. زراعة الخلايا المعالجة الفرعية بنسبة انقسام من واحد إلى 10 حتى تصل إلى 80٪ أو أعلى من صلاحية الخلية.
قبل بذر الخلايا ، غمر غطاء Poly-D-Lysine المعقم ، المطلي باللامينين ، المستدير بقطر 12 مم في 70٪ إيثانول. جفف زلات الغطاء باستخدام مناديل خالية من النسالة ، وضع زلات الغطاء النظيفة في الآبار المناسبة للوحة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني بدون أيونات المغنيسيوم والكالسيوم.
أضف 0.25٪ تربسين لفصل خلايا الالتصاق عن القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث دقائق. ثم أضف DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ من البنسلين والستربتومايسين إلى الخلايا. ماصة بلطف صعودا وهبوطا.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في DMEM المكملة ب 0.5٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين. عد خلايا البقع الزرقاء تريبان باستخدام مقياس الدم تحت المجهر الضوئي والبذور بكثافة مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من صفيحة 24 بئرا.
وزع الخلايا بالتساوي عن طريق هز اللوحة برفق. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثماني ساعات ، استبدل وسائط الاستزراع القديمة ب 50٪ من أكسيد الديوتيريوم والفينيل ألانين الزائد أو 50٪ من أكسيد الديوتيريوم ووسط التربتوفان الزائد.
أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 36 ساعة. الآن إعداد شرائح المجهر مع مساحات التصوير تسعة مم في القطر. ضع 15 ميكرولترا من برنامج تلفزيوني ، مع استكمال أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم وشطف الخلايا بنفس المحلول.
أضف 0.5 مل من محلول بارافورمالدهيد الخالي من الميثانول بنسبة 4٪ واترك اللوحة تحت غطاء السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة. نضح محلول بارافورمالدهايد وشطفه باستخدام برنامج تلفزيوني ، مع استكمال الكالسيوم والحديد المغنيسيوم مرتين. أضف مل واحد من برنامج تلفزيوني ، مكمل بأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم إلى كل بئر.
استخدم ملاقط معقمة لإزالة زلات الغطاء من كل بئر بعناية. اعكسها وضع الخلية التي تحتوي على الجانب على مساحات التصوير الملامسة ل PBS. أغلق الطبقة الخارجية من غطاء الغطاء باستخدام فاصل التصوير باستخدام طلاء أظافر شفاف.
حمل العينة البيولوجية على حامل العينة أسفل العدسة الشيئية مباشرة. ثم انقر فوق رمز الكاميرا في البرنامج لتشغيل كاميرا الفيديو وضبط مستوى التركيز لتحديد منطقة الاهتمام باستخدام العدسة الموضوعية 50X. قم بالتبديل إلى العدسة الموضوعية 100X.
انقر فوق رمز الإيقاف لإيقاف تشغيل كاميرا الفيديو. ثم حدد صريفا يبلغ 1،800 خط لكل مم واضبط نطاق الاستحواذ من 400 إلى 3،150 سم معكوسا. أخيرا ، اضبط وقت الاستحواذ على 90 ثانية والتراكم على ثلاثة و binning على أربعة لأقل ضوضاء وطيف أكثر دقة.
انقر فوق ابدأ لتسخين الليزر. ابدأ بالضغط على المفتاح الرئيسي لصندوق التحكم IX3CBH إلى تشغيل ، متبوعا بالمفتاح الرئيسي لوحدة التحكم في لوحة اللمس. ثم قم بتشغيل المفتاح الرئيسي لمحول التيار المتردد لمصدر الطاقة لجهاز التحكم عن بعد بالليزر LDOBIS6 متصل بمشط مجمع الليزر الرئيسي FV31S.
قم أيضا بتشغيل محول التيار المتردد الخاص بمصدر طاقة الليزر عن بعد LDOBIS6 المتصل بمشط FV31S لمجمع الليزر الفرعي. بعد ذلك ، اضغط على المفاتيح الرئيسية لكاشف الصمام الثنائي الضوئي SI ومكبر صوت القفل. اضبط الأشعة تحت الحمراء لليزر على 1031 نانومتر اضبط نظام الزمرد بيكو على الطول الموجي القابل للضبط بين 720 إلى 990 نانومتر.
قم بتركيب العينة على الزيت وضع قطرة ماء كبيرة على شريحة المجهر حيث يتم تثبيت العينة. حدد حجم المسح الضوئي ك 512 × 512 بكسل. الحصول على الصور وحفظها كأوليمبوس.
ملف رسم OIR. بعد ضبط الإشارة على 862.0 ، احصل على صورة خلفية واحفظها. اضبط وقت السكون على ثمانية ميكروثانية لكل بكسل وحجم البكسل على 512 × 512 بكسل.
اضبط معلمة طاقة مصراع الليزر على 150 مللي واط لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد ، قم بضبط خسارة رامان المحفزة على عكس 2،850 سم. بمجرد تحديد الخلايا المفردة المطلوبة ، قم بتسجيل الليزر للمسح من مستوى التركيز العلوي لاكتشاف الطبقات العلوية والسفلية لتلك الخلايا. تم استخدام أكسيد الديوتيريوم ، الذي تم فحصه ، وتشتت رامان المحفز لتصور التوزيع المكاني لإشارات CD على الخلايا المفردة.
أظهرت الخلايا الضابطة شرائط CD والدهون والبروتين المعتدلة. ومع ذلك ، أظهرت رحلة 15 × فولت و 15 × حظرا أقوى للدهون والبروتين. أشار التحليل الكمي إلى أن الأحماض الأمينية العطرية الزائدة قد تنظم تخليق الدهون بنسبة 10 إلى 17٪ ولكنها تقلل من تخليق البروتين بنسبة 10٪ أظهر التحليل المتري للخلايا المعالجة بالأحماض الأمينية العطرية زيادة بنسبة 50٪ في الفلافين مقسوما على الفلافين بالإضافة إلى NADH وزيادة بنسبة 10٪ في الدهون غير المشبعة مقسومة على الدهون المشبعة.
يتم عرض إسقاط حجم قطرات الدهون Raman 3D المحفزة في خلايا المعالج تحت السيطرة وظروف الأحماض الأمينية العطرية الزائدة. أظهرت التحليلات الكمية لقطرات الدهون 3D زيادة في الأعداد ، ولكن انخفاضا في الحجم في الخلايا المعالجة بالأحماض الأمينية العطرية مقارنة بالسيطرة. يجب تحسين معلمات التصوير لرامان واثنين من التصوير الفلوري الفوتوني من عينة إلى أخرى لضمان أفضل جودة تصوير.
يمكن للأفراد إقران نظامنا بالجيل التوافقي الثاني لدراسة بنية الكولاجين ، والتي توضح التغيرات الأيضية المبكرة في الشيخوخة والأمراض ، وفهم تطور التنكس العصبي أو السرطان. تقنيتنا هي الأولى من نوعها لتصور تخليق الدهون والبروتين في الأنظمة البيولوجية بدقة عالية تحت الخلية. يمكن أيضا ترجمة التكنولوجيا إلى عيادة للكشف عن الأمراض غير الغازية.
