Wir präsentieren ein neues Bildgebungsverfahren mit markierungsfreier Fähigkeit, hoher chemischer Spezifität und subzellulärer Auflösung. Unsere Methodik kann eine Frage zu metabolischer Dysfunktion beim Altern und Krankheiten wie Krebs beantworten Raman-Bildgebung, gekoppelt mit Zwei-Photonen-Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen, bietet eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnologie, die eine minimale Probenvorbereitung erfordert und eine hohe subzelluläre Auflösung erreicht, ohne die Zellprobe zu beschädigen. Als Teil unserer Plattform werden mehrere Bildgebungsmodalitäten betrieben.
Einzelpersonen sollten unser Protokoll nach bestem Wissen und Gewissen befolgen und beachten, dass unser System hausgemacht ist. Auf dem Weg dorthin sollten sie ihre eigene Praxis entwickeln, um den Erfolg sicherzustellen. Beginnen Sie in zwei separaten Röhrchen mit dem Abmessen und Mischen von 10 Milligramm DMEM-Pulver mit 4,7 Millilitern doppelt destilliertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Für beide Röhrchen 4,7 ml Deuteriumoxid, 0,5 ml FBS und 0,1 ml Penicillin und Streptomycin hinzufügen, bevor Sie das Röhrchen vortexen und invertieren. Als nächstes geben Sie überschüssiges Phenylalanin in ein Röhrchen und überschüssiges Tryptophanpulver in das zweite Röhrchen und mischen Sie erneut.
Methionin und Threonin mit 30 bzw. 95 mg pro ml in beide Röhrchen geben, gefolgt von Vortexen und Invertieren des Röhrchens. Anschließend filtrieren Sie das vorbereitete Medium mit einem 25-Millimeter-Spritzenvorsatzfilter mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Versiegeln Sie alle konischen Röhrchen des Mediums mit Parafilm.
Vorbereitete Medien bei vier Grad Celsius lagern. Halten Sie Heilerzellen in einer Kulturflasche unter Verwendung von Standard-DMEM, das mit 10 % FBS, 1 % Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Subkultivieren Sie die Heilerzellen in einem Split-Verhältnis von eins zu 10, bis die Zelllebensfähigkeit von 80 % oder höher erreicht ist.
Vor der Aussaat der Zellen werden die sterilisierten, lamininbeschichteten, runden Deckgläser aus Poly-D-Lysin mit einem Durchmesser von 12 mm in 70%iges Ethanol getaucht. Trocknen Sie die Deckgläser mit fusselfreien Tüchern ab und legen Sie die sauberen Deckgläser in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Magnesium- und Kalziumionen.
Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um die Adhärenzzellen vom Kolben zu trennen, und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin und Streptomycin zu den Zellen. Pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten.
Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 g für drei Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Als nächstes werden die Zellen in DMEM resuspendiert, ergänzt mit 0,5 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin. Zählen Sie die Trypanblau-Färbezellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop und säen Sie sie mit einer Dichte von zwei mal 10 bis zur fünften Zelle pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Platte leicht schütteln. Bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie nach acht Stunden das alte Nährmedium durch 50 % Deuteriumoxid und überschüssiges Phenylalanin oder 50 % Deuteriumoxid und überschüssiges Tryptophanmedium.
Die Zellen werden 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator zurückgelegt. Bereiten Sie nun Objektträger mit Abbildungsräumen von neun mm Durchmesser vor. Geben Sie 15 Mikroliter PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, und spülen Sie die Zellen mit der gleichen Lösung.
Fügen Sie 0,5 ml 4%ige methanolfreie Paraformaldehydlösung hinzu und lassen Sie die Platte 15 Minuten lang unter der Biosicherheitshaube. Saugen Sie die Paraformaldehydlösung an und spülen Sie sie mit PBS, ergänzt mit zweimal Kalzium und Magnesiumeisen. Geben Sie einen ml PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, in jede Vertiefung.
Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus jeder Vertiefung zu entfernen. Drehen Sie sie um und legen Sie die Zellseite auf die Bildräume, die mit dem PBS in Kontakt stehen. Versiegeln Sie die äußere Schicht des Deckglases mit dem Abstandshalter mit transparentem Nagellack.
Legen Sie die biologische Probe auf den Probenhalter direkt unter der Objektivlinse. Klicken Sie dann auf das Kamerasymbol in der Software, um die Videokamera einzuschalten, und passen Sie die Fokusebene an, um einen Interessenbereich mit dem 50X-Objektiv zu identifizieren. Wechseln Sie zum 100X-Objektiv.
Klicken Sie auf das Stopp-Symbol, um die Videokamera auszuschalten. Wählen Sie dann ein Gitter von 1.800 Linien pro mm und stellen Sie den Erfassungsbereich von 400 bis 3.150 Zentimeter umgekehrt ein. Stellen Sie abschließend die Erfassungszeit auf 90 Sekunden, die Akkumulation auf drei und das Binning auf vier Sekunden ein, um das geringste Rauschen und das genaueste Spektrum zu erzielen.
Klicken Sie auf Start, um den Laser aufzuwärmen. Drücken Sie zunächst den Hauptschalter der Steuerbox IX3CBH auf Ein, gefolgt vom Hauptschalter des Touchpanel-Controllers. Schalten Sie dann den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LDOBIS6 Laserfernbedienung ein, die mit dem Hauptkamm des Laserkombinators FV31S verbunden ist.
Schalten Sie auch das Netzteil der LDOBIS6 Laser-Fernstromversorgung ein, die an den Sub-Laser-Combiner FV31S-Kamm angeschlossen ist. Drücken Sie danach die Hauptschalter des SI-Fotodiodendetektors und des Lock-in-Verstärkers ein. Stellen Sie das Laser-IR auf 1031 Nanometer ein Stellen Sie das Pico-Smaragdsystem auf eine abstimmbare Wellenlänge zwischen 720 und 990 nm ein.
Montieren Sie die Probe auf das Öl und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger, wo die Probe fixiert ist. Wählen Sie die Scangröße als 512 x 512 Pixel aus. Erfassen und speichern Sie die Bilder als Olympus.
OIR-Grafikdatei. Nachdem Sie das Signal auf 862.0 eingestellt haben, erfassen Sie ein Hintergrundbild und speichern Sie es. Stellen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden pro Pixel und die Pixelgröße auf 512 x 512 Pixel ein.
Stellen Sie den Parameter für die Laserverschlussleistung auf 150 Milliwatt ein Für die 3D-Bildrekonstruktion stellen Sie den stimulierten Raman-Verlust auf 2.850 cm invers. Sobald die gewünschten Einzelzellen identifiziert wurden, registrieren Sie den Laser, um von der oberen Fokusebene aus zu scannen, um die oberen und unteren Schichten dieser Zellen zu erkennen. Deuteriumoxid, sondierte, stimulierte Raman-Streuung wurde verwendet, um die räumliche Verteilung von CD-Signalen auf einzelnen Zellen sichtbar zu machen.
Die Kontrollzellen wiesen moderate CD-, Lipid- und Proteinbanden auf. Der 15 x v und 15 x Trip zeigte jedoch stärkere CD-Lipid- und Proteinverbote. Die quantitative Analyse zeigte, dass überschüssige aromatische Aminosäuren die Lipidsynthese um 10 bis 17 % hochregulieren, aber die Proteinsynthese um 10 % herunterregulieren können. Die metrische Analyse der mit aromatischen Aminosäuren behandelten Zellen zeigte einen 50%igen Anstieg des Flavins geteilt durch Flavin plus NADH und einen 10%igen Anstieg des ungesättigten Lipids geteilt durch gesättigtes Lipid.
Die stimulierte Raman-3D-Lipidtröpfchen-Volumenprojektion in Heilerzellen unter Kontrolle und überschüssigen aromatischen Aminosäuren wird gezeigt. Quantitative Analysen von 3D-Lipidtröpfchen zeigten einen Anstieg der Anzahl, aber eine Verringerung der Größe der mit aromatischen Aminosäuren behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Die Bildgebungsparameter für die Raman- und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung sollten von einer Probe zur nächsten optimiert werden, um die beste Bildqualität zu gewährleisten.
Individuen können unser System mit der zweiten harmonischen Generation koppeln, um die Kollagenstruktur zu untersuchen, die frühe metabolische Veränderungen beim Altern und bei Krankheiten aufklärt, und um das Fortschreiten von Neurodegeneration oder Krebs zu verstehen. Unsere Technologie ist die erste dieser Art, um die Lipid- und Proteinsynthese in biologischen Systemen mit hoher subzellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Die Technologie kann auch in der Klinik zur nicht-invasiven Erkennung von Krankheiten eingesetzt werden.
