הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

אנו מציגים טכניקת הדמיה חדשה עם יכולת ללא תוויות, ספציפיות כימית גבוהה ורזולוציה תת-תאית. המתודולוגיה שלנו יכולה לענות על שאלות על תפקוד מטבולי לקוי בהזדקנות ומחלות כגון סרטן דימות ראמאן, יחד עם שני פוטונים פלואורסצנטיים ויצירת הרמוניה שנייה, מציעה טכנולוגיית הדמיה לא הרסנית ונטולת תוויות הדורשת הכנת דגימה מינימלית ומשיגה רזולוציה תת-תאית גבוהה מבלי לפגוע בדגימת התא. מספר שיטות הדמיה מופעלות כחלק מהפלטפורמה שלנו.

אנשים צריכים לעקוב אחר הפרוטוקול שלנו כמיטב יכולתם, ולציין כי המערכת שלנו בנויה בבית. לאורך הדרך הם צריכים לפתח תרגול משלהם כדי להבטיח הצלחה. בשני צינורות נפרדים להתחיל על ידי מדידה וערבוב 10 מיליגרם של אבקת DMEM עם 4.7 מיליליטר של מים מזוקקים כפול בצינור חרוטי 15 מ"ל.

מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב. עבור שני הצינורות, הוסף 4.7 מ"ל של תחמוצת דאוטריום, 0.5 מ"ל של FBS, ו 0.1 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין לפני מערבול והיפוך הצינור. לאחר מכן, להוסיף עודף פנילאלנין לצינור אחד עודף אבקת טריפטופן לצינור השני ולערבב שוב.

הוסף מתיונין ותראונין במינון של 30 ו-95 מ"ג למ"ל, בהתאמה, לשני הצינורות, ולאחר מכן מערבל והופך את הצינור. לאחר מכן, סנן את המדיה מוכנה עם מסנן מזרק 25 מ"מ עם מסננים 0.22 מיקרומטר. אטם את כל המדיה הכיל צינורות חרוטיים עם Parafilm.

אחסנו מדיה מוכנה בארבע מעלות צלזיוס. שמור על תאי ריפוי בבקבוק תרבית באמצעות DMEM סטנדרטי בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין. תרבית משנה של תאי המרפא ביחס פיצול של אחד עד 10 עד הגעה ל-80% או יותר כדאיות התא.

לפני זריעת התאים, השקיעו את פולי-די-ליזין מעוקר, מצופה למינין, מחליקי כיסוי עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול 70%. יבשו את החלקות הכיסוי באמצעות מגבונים ללא מוך, והניחו את החלקות הכיסוי הנקיות בבארות המתאימות של הצלחת. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ללא יוני מגנזיום וסידן.

הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק את תאי ההיצמדות מהבקבוק ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש דקות. לאחר מכן הוסף DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין לתאים. פיפטה עדינה למעלה ולמטה.

לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים DMEM בתוספת 0.5% FBS ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין. ספרו את תאי הכתם הכחול טריפאן באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור וזרעו בצפיפות של פי שניים 10 עד התאים החמישיים לכל באר של צלחת 24 באר.

פזרו את התאים באופן שווה על ידי ניעור הצלחת בעדינות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שמונה שעות, החליפו את אמצעי התרבית הישנים בתחמוצת דאוטריום 50% ועודף פנילאלנין או 50% תחמוצת דאוטריום ועודף טריפטופן.

להחזיר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך 36 שעות. כעת הכינו שקופיות מיקרוסקופ עם חללי הדמיה בקוטר תשעה מ"מ. מניחים 15 מיקרוליטר של PBS, בתוספת יוני סידן ומגנזיום ושוטפים את התאים באותה תמיסה.

הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד נטולת מתנול 4% והשאירו את הצלחת מתחת למכסה המנוע למשך 15 דקות. שאפו את תמיסת הפרפורמאלדהיד ושטפו אותה עם PBS, בתוספת סידן ומגנזיום ברזל פעמיים. הוסיפו מ"ל אחד של PBS, בתוספת יוני סידן ומגנזיום לכל באר.

השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי מכל באר. הפוך אותם והנח את התא המכיל צד על חללי ההדמיה במגע עם PBS. אטמו את השכבה החיצונית של חלקת הכיסוי עם מרווח ההדמיה באמצעות לק שקוף.

יש להעמיס את הדגימה הביולוגית על מחזיק הדגימה ישירות מתחת לעדשת המטרה. לאחר מכן לחץ על סמל המצלמה בתוכנה כדי להפעיל את מצלמת הווידאו ולהתאים את מישור המיקוד כדי לזהות אזור עניין עם עדשת האובייקט 50X. עבור לעדשה האובייקטיבית 100X.

לחץ על סמל העצירה כדי לכבות את מצלמת הווידאו. לאחר מכן בחר סורג של 1, 800 שורות למ"מ ולהגדיר את טווח הרכישה מ 400 ל 3, 150 ס"מ הפוך. לבסוף, הגדר את זמן הרכישה ל -90 שניות, את ההצטברות לשלוש ואת הבינינג לארבע עבור הרעש הקטן ביותר ואת הספקטרום המדויק ביותר.

לחץ על התחל כדי לחמם את הלייזר. התחל בלחיצה על המתג הראשי של תיבת הבקרה IX3CBH למצב מופעל, ואחריו על המתג הראשי של בקר לוח המגע. לאחר מכן הפעל את המתג הראשי של מתאם החשמל של ספק הכוח עבור שלט הלייזר LDOBIS6 המחובר למסרק הלייזר הראשי FV31S.

הפעל גם את מתאם החשמל של ספק הכוח המרוחק לייזר LDOBIS6 המחובר למסרק הלייזר המשולב FV31S. לאחר מכן, לחץ על המתגים הראשיים של גלאי פוטודיודה SI ומגבר נעילה מופעל. הגדר את IR הלייזר על 1031 ננומטר הגדר את מערכת פיקו אמרלד באורך גל בין 720 ל 990 ננומטר.

הרכיבו את הדגימה על השמן והניחו טיפת מים גדולה על שקופית המיקרוסקופ שבה הדגימה קבועה. בחר גודל סריקה כ- 512 על 512 פיקסלים. רכוש ושמור את התמונות כאולימפוס.

קובץ גרפי OIR. לאחר הגדרת האות ל- 862.0, רכוש תמונת רקע ושמור אותה. התאם את זמן השהייה לשמונה מיקרו-שניות לפיקסל ואת גודל הפיקסלים ל- 512 על 512 פיקסלים.

הגדר את פרמטר עוצמת תריס הלייזר ל- 150 מילי-וואט לשחזור תמונה תלת-ממדית, כוונן את אובדן הרמאן המגורה ל-2, 850 ס"מ הופכי. לאחר זיהוי התאים הבודדים הרצויים, רשום את הלייזר כדי לסרוק ממישור המיקוד העליון כדי לזהות את השכבות העליונות והתחתונות של תאים אלה. נעשה שימוש בפיזור ראמאן של תחמוצת דאוטריום (Deuterium oxide), שנבדק ומגורה כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של אותות CD על תאים בודדים.

תאי הבקרה הציגו פסי CD, שומנים וחלבונים מתונים. עם זאת, הטריפ של 15 x v ו- 15 x הציג איסורים חזקים יותר על שומנים ב- CD וחלבון. ניתוח כמותי הצביע על כך שעודף חומצות אמינו ארומטיות עשוי להגביר את סינתזת השומנים ב-10% עד 17%, אך להפחית את ויסות סינתזת החלבונים ב-10%ניתוח מטרי של חומצות אמינו ארומטיות התאים שטופלו הראה עלייה של 50% בפלבין חלקי פלבין בתוספת NADH ועלייה של 10% בשומנים בלתי רוויים חלקי שומנים רוויים.

הקרנת נפח טיפות השומנים התלת-ממדית של ראמאן המגורה בתאי מרפא תחת בקרה ותנאי חומצות אמינו ארומטיות עודפות מוצגים. ניתוחים כמותיים של טיפות שומנים תלת-ממדיות הראו עלייה בספירה, אך ירידה בגודל חומצות אמינו ארומטיות שטופלו בתאים בהשוואה לקבוצת הביקורת. יש למטב את פרמטרי ההדמיה של ראמאן ושני פוטונים פלואורסצנטיים מדגימה אחת לשנייה כדי להבטיח את איכות ההדמיה הטובה ביותר.

אנשים יכולים לשדך את המערכת שלנו עם הדור ההרמוני השני כדי לחקור את מבנה הקולגן, אשר מבהיר שינויים מטבוליים מוקדמים בהזדקנות ובמחלות, ולהבין את ההתקדמות של ניוון עצבי או סרטן. הטכנולוגיה שלנו היא הראשונה מסוגה הממחישה סינתזת שומנים וחלבונים במערכות ביולוגיות ברזולוציה תת-תאית גבוהה. הטכנולוגיה יכולה להיות מתורגמת גם למרפאה לגילוי מחלות לא פולשניות.