我们展示了一种具有无标记能力、高化学特异性和亚细胞分辨率的新成像技术。我们的方法可以回答有关衰老和癌症等疾病代谢功能障碍的问题 拉曼成像，加上两个光子荧光和二次谐波产生，提供了一种无损且无标记的成像技术，需要最少的样品制备，并在不损坏细胞样品的情况下实现高亚细胞分辨率。几种成像模式作为我们平台的一部分运行。
个人应尽其所能遵循我们的协议，并注意我们的系统是自制的。在此过程中，他们应该发展自己的实践以确保成功。在两个单独的管中，首先在 15 mL 锥形管中测量和混合 10 毫克 DMEM 粉末与 4.7 毫升双蒸水。
彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。对于两个试管，在涡旋和倒置试管之前，加入 4.7 mL 氧化氘、0.5 mL FBS 和 0.1 mL 青霉素和链霉素。接下来，将过量的苯丙氨酸加入一个管中，将过量的色氨酸粉加入第二个管中，然后再次混合。
向两个试管中分别以每毫升30和95毫克的剂量加入蛋氨酸和苏氨酸，然后涡旋并倒置试管。之后，用带有0.22微米过滤器的25毫米注射器过滤器过滤准备好的培养基。用石蜡膜密封所有包含锥形管的介质。
将准备好的培养基储存在四摄氏度。使用补充有10%FBS，1%青霉素和链霉素的标准DMEM将愈合细胞维持在培养瓶中。以1:10的分裂比传代愈合细胞，直到达到80%或更高的细胞活力。
在接种细胞之前，将灭菌的聚-D-赖氨酸，层粘连蛋白包被，直径为12毫米的圆形盖玻片浸没在70%乙醇中。使用不起毛的湿巾擦干盖玻片，然后将干净的盖玻片放入板的适当孔中。用不含镁和钙离子的PBS洗涤细胞一次。
加入0.25%胰蛋白酶将粘附细胞从烧瓶中解离，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三分钟。然后将补充有10%FBS，1%青霉素和链霉素的DMEM添加到细胞中。轻轻上下移液。
通过在室温下以300G离心三分钟来收集细胞。接下来，将细胞重悬于补充有0.5%FBS和1%青霉素和链霉素的DMEM中。在光学显微镜下使用血细胞计数器计数台盼蓝染色细胞，并以密度为2倍10至24孔板的第五个细胞接种。
通过轻轻摇动板来均匀分布细胞。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。八小时后，用50%氧化氘和过量的苯丙氨酸或50%氧化氘和过量的色氨酸培养基替换旧的培养基。
将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下返回培养箱36小时。现在准备具有直径9毫米成像空间的显微镜载玻片。放入15微升PBS，补充钙和镁离子，并用相同的溶液冲洗细胞。
加入 0.5 mL 4% 无甲醇多聚甲醛溶液，将板放在生物安全罩下 15 分钟。吸出多聚甲醛溶液并用PBS冲洗，并补充钙和镁铁两次。向每个孔中加入一mL PBS，并补充钙和镁离子。
使用无菌镊子小心地从每个孔中取出盖玻片。将它们倒置并将包含细胞的一侧放在与PBS接触的成像空间上。使用透明指甲油用成像垫片密封盖玻片的外层。
将生物样品装载到物镜正下方的样品架上。然后单击软件上的相机图标以打开摄像机并调整焦平面以使用50X物镜识别感兴趣的区域。切换到100X物镜。
单击停止图标以关闭摄像机。然后选择每毫米1， 800线的光栅，并将采集范围从400设置为3， 150厘米反转。最后，将采集时间设置为 90 秒，将累积设置为 3，将合并设置为 4，以获得最小的噪声和最准确的频谱。
单击开始以预热激光。首先按下控制盒IX3CBH的主开关至开，然后按下触摸屏控制器的主开关。然后打开电源AC适配器的主开关LDOBIS6激光遥控器连接到主激光组合器FV31S梳。
同时打开连接到子激光组合器 FV31S 梳的 LDOBIS6 激光远程电源的交流适配器。之后，按下 SI 光电二极管检测器和锁相放大器的主开关。将激光红外设置为 1031 纳米 将微微祖母绿系统设置为介于 720 到 990 nm 之间的可调波长。
将样品安装在油上，并在固定样品的显微镜载玻片上放置一个大水滴。选择扫描大小为 512 x 512 像素。获取图像并将其保存为奥林巴斯。
OIR图形文件。将信号设置为 862.0 后，获取背景图像并保存。将停留时间调整为每像素 8 微秒，将像素大小调整为 512 x 512 像素。
将激光快门功率参数设置为 150 毫瓦 对于 3D 图像重建，将受激拉曼损失调整为 2， 850 cm 逆。一旦确定了所需的单个细胞，就将激光注册为从顶部焦点平面扫描，以检测这些细胞的顶层和底层。使用氧化氘、探测、受激拉曼散射来可视化CD信号在单个细胞上的空间分布。
对照细胞显示中等的CD条带、脂质条带和蛋白质条带。然而，15 x v 和 15 x 跳闸显示出更强的 CD 脂质和蛋白质禁令。定量分析表明，过量的芳香族氨基酸可能会将脂质合成上调10%至17%，但将蛋白质合成下调10%芳香族氨基酸处理细胞的比例指标分析显示，黄素除以黄素加NADH增加50%，不饱和脂质除以饱和脂质增加10%。
显示了受刺激的拉曼3D脂滴体积在控制下愈合细胞中的体积投影和过量的芳香族氨基酸条件。3D脂滴的定量分析显示，与对照相比，计数增加，但芳香族氨基酸处理细胞的大小减小。拉曼和双光子荧光成像的成像参数应从一个样品到下一个样品进行优化，以确保最佳成像质量。
个人可以将我们的系统与二次谐波生成相结合，以研究胶原蛋白结构，阐明衰老和疾病的早期代谢变化，并了解神经变性或癌症的进展。我们的技术是第一个以高亚细胞分辨率可视化生物系统中脂质和蛋白质合成的技术。该技术还可以转化为临床，用于非侵入性疾病检测。
