Bu projede kullanılan Adeno ile ilişkili virüsün üretimini finanse ettikleri için Penncore ve NHLBI Gen Terapisi Kaynak Programına (GTRP) teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) (1R01HL140468) ve Miami Kalp Araştırma Enstitüsü'nden LS'ye verilen hibelerle finanse edildi. MW, 2020 - 2022 yılları arasında NIH Çeşitlilik Ek Ödülü'nün (R01HL140468- 03S1) sahibiydi. JH, 1R01 HL13735, 1R01 HL107110, 5UM1 HL113460, 1R01 HL134558, 5R01 CA136387 (NIH'den), W81XWH-19-PRMRPCTA (Savunma Bakanlığı'ndan) ve Starr, Lipson ve Soffer Aile Vakıfları tarafından finanse edilmektedir.

Hayvan protokolü, Miami Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) yönergelerine (IACUC protokolü 23-103-ad03) uygun olarak onaylandı. Bu çalışma için, 129J arka planındaki vahşi tip (WT) fareler ticari bir kaynaktan elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve şirket içinde yetiştirildi. Tüm fareler 129J arka plan üzerinde littermat idi. Deneyler hem erkek hem de dişi fareleri içeriyordu. LDLR / P-407 HFpEF faresi, birinci haftada tek bir doz AAV9-cTnT-LDLR ve dört hafta boyunca iki haftada bir p407 uygulanarak oluşturulmuştur.
1. AAV9-cTnT-LDLR hazırlama ve uygulama
NOT: AAV9-cTNT-hLDLR plazmidi (Malzeme Tablosuna bakınız) tam insan LDLR proteinini (2664bp) kodlar (Şekil 1).
<ol><li>AAV-LDLR viral vektör hazırlama<ol><li>Hayvan sayısına bağlı olarak, AAV9 stok şişelerini 20 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün, ardından 100 μL'de 1 x10 12 vektör genomu/fare konsantrasyonu elde etmek için AAV parçacıklarını Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) seyreltin.</li>
		<li>Viral çözeltiyi 1 mL'lik bir şırınga üzerinde 28-30 G'lik bir iğneye yerleştirin. İğnenin içine hava kabarcıkları çekmemeye dikkat edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntravenöz (i.v.) kuyruk ven enjeksiyon işlemleri<ol><li>Oksijeni 0,5 L/dk'ya kadar açın ve izofluran anestezi sistemini %4-%5'e ayarlayın. Fareyi, hayvan yanıt vermeyene kadar ~ 2 dakika boyunca indüksiyon odasına yerleştirin.</li>
		<li>Hayvanı bir fare kuyruğu aydınlatıcı tutucunun (örneğin, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) üzerine yerleştirin ve hayvanı yan yatarak yerleştirin. Bakım için% 2 -% 3'e kadar izofluran anestezisi kullanın. NOT: Kısıtlayıcı cihaz tarafından ısıtılması, farelerin kuyruk damarının genişlemesine neden olacak ve bu nedenle enjekte edilmesini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.</li>
		<li>Yanal kuyruk damarını tanımlayın. Enjeksiyon alanını bir gazlı bez kullanarak antiseptik ile temizleyin.</li>
		<li>Uzatmak için kuyruğun ucunu tutun ve damar görüntülenene kadar fare kuyruğuna parmaklarınızla masaj yapın. İğneyi düşük bir açıyla (10-15 derecelik açı) yerleştirin ve kuyruk damarına 100 μL seyreltilmiş AAV enjekte edin (Şekil 2A).</li>
		<li>İğneyi geri çekin ve kanama durana kadar hemen parmağınızla baskı uygulayın. Fareyi orijinal kafesine geri koyun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. P-407 hazırlanması ve uygulanması
<ol><li>P-407 hazırlama<ol><li>P-407 ajanını (Malzeme Tablosuna bakınız) DPBS ile bir çeker ocak içinde 100 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek çözeltiyi hazırlayın. P-40710'un çözülmesini kolaylaştırmak için çözeltiyi gece boyunca 4 °C'de bir döndürücü üzerinde soğutun.</li>
	</ol></li>
	<li>İki haftada bir intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon prosedürü<ol><li>Her fareyi i.p. enjeksiyonlarının ilk gününde tartın. 1 g / kg formülünü kullanarak, ağırlıklara göre her fare için uygun dozu hesaplayın ve şırıngaları önceden doldurun.</li>
		<li>Çeker ocak altında, iç organları kafatası olarak yeniden konumlandırmak için fareyi baş ve gövde aşağı doğru eğik olacak şekilde manuel olarak tutun. Bu teknik, çevredeki hayati yapıların delinmesini önler.</li>
		<li>Karnın alt kadranında, orta hattın lateralinde sol periton boşluğunu tanımlayın. Bölgeyi antiseptik ile temizleyin.</li>
		<li>45 derece veya daha az bir açıyla iğneyi periton boşluğuna yerleştirin (Şekil 2B). Yeterli yerleştirmeyi sağlamak için şırıngayı aspire edin.</li>
		<li>Aspirasyonda kan veya doku varsa, iğneyi geri çekin ve şırınga berraklaşana kadar 2.2.2 -2.2.4 adımlarını tekrarlayın. İğneyi uygun kesici alet kabına atın ve fareyi orijinal kafesine geri koyun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ekokardiyografi değerlendirmesi
<ol><li>Hazırlık<ol><li>Tüy dökücü kremi farenin göğsüne ve üst karnına görüntülemeden bir gün önce veya birkaç saat önce uygulayın. 2 dakika sonra kremayı ıslak gazlı bezle çıkarın.</li>
		<li>Fareyi 0.8 L / dak akış hızında% 2.5 -% 3.0 izofluran ile uyuşturun ve% 1 -% 1.5 izofluran ile koruyun. Ardından, fareyi sırtüstü pozisyonda uygun platforma, pençeleri iletken jel ile elektrot pedleri üzerinde olacak şekilde sabitleyin ve izofluran ile sürekli anestezi sağlamak için burnu ve ağzı bir burun konisi ile kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Parasternal uzun eksen görünümü<ol><li>Fare sırtüstü konumdayken, platformun sağ tarafını 45 derece eğin.</li>
		<li>Daha sonra, B modu görüntülerini elde etmek ve saklamak için sağ üst ekstremiteden sol karın bölgesine kadar saat yönünde 30-40 derece açı vererek dönüştürücü probunu ray sisteminde çapraz olarak hizalayın.</li>
		<li>Ejeksiyon fraksiyonunu elde etmek için ultrason analiz yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak B-modu görüntülerini analiz edin (Şekil 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Parasternal kısa eksen görünümü<ol><li>B modu ve M modu görüntülerini elde etmek ve saklamak için ray sistemindeki dönüştürücü probunu saat yönünde 90 derece döndürün.</li>
	</ol></li>
	<li>Apikal görünüm<ol><li>Platformun sol üst köşesini aşağı ve sağa doğru eğin. Dönüştürücüyü hayvanın sağ omzuna doğru yönlendirin.</li>
		<li>Mitral kapağı B modunda ve renkli Doppler modunda görselleştirin. Darbeli dalga (PW) Doppler ve doku Doppler görüntülerinin elde edilmesi ve saklanması5.</li>
		<li>IVRT, E/E' ve E/A'yı elde etmek için ultrason analiz yazılımını kullanarak PW Doppler ve doku Doppler görüntülerini analiz edin (Şekil 3B-E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Basınç-hacim (PV) döngü veri kaydı
<ol><li>Çalışmanın sonunda, daha önce açıklanan prosedürü11,12 izleyerek sol ventrikül (LV) sistolik ve diyastolik fonksiyonunu değerlendirmek için hemodinamik analizler yapın.<ol><li>Fareyi izofluran (% 3-5, indüksiyon odası) ile indükleyerek başlayın.</li>
		<li>Anestezik etki başladığında, hayvanı cerrahi tezgaha aktarın ve izofluran (% 1-3, yüz maskesi) ile anesteziyi sürdürün.</li>
		<li>Endotrakeal entübasyona (ağız yoluyla) izin vermek için boynun üzerindeki deride küçük bir kesi yapın.</li>
		<li>Hayvanı, ~ 0.15-0.2 mL hacme ve solunum hızı 120-170 nefes / dk'ya ayarlanmış bir kemirgen ventilatörü (örneğin, Mikro havalandırma modeli 848, Harvard Aparatı) kullanarak oksijen ve izofluran karışımı ile havalandırın.</li>
		<li>Sıcaklık kontrollü bir cerrahi masa kullanarak işlem boyunca vücut sıcaklığını ~ 37 ° C ± 1 ° C'de izleyin.</li>
		<li>Sıvı desteği uygulaması için sol iç juguler veni 30 G'lik bir iğne ile açığa çıkarın ve kanüle edin.</li>
		<li>Cildi medyan ventral boynun bölgesinden kesin ve karotis arteri ortaya çıkarın. Sağ karotis arterin distal kısmının tıkanmasından sonra, sol ventriküle mikro uçlu bir basınç-hacim (PV) kateterinin (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirilmesine izin vermek için arterde küçük bir kesi yapın (kapalı göğüs yaklaşımı).</li>
		<li>Kararlı durum ve inferior vena kava oklüzyonu sırasında PV döngülerini kaydedin.</li>
		<li>Deneyin sonunda, onaylanmış bir AVMA yöntemi (örneğin, İzofluran ve ardından servikal çıkık) kullanarak hayvanı (derin anestezi altında) insancıl olarak ötenazi yapın.</li>
		<li>LabChart yazılımını kullanarak PV verilerini analiz edin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ekokardiyografik ölçümleri kullanarak hacimleri kalibre edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Hiperlipidemiye Bağlı Fare Modelinde HFpEF Patofizyolojisinin İncelenmesi

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+heart+failure:+A+contemporary+perspective.">Epidemiology of heart failure: A contemporary perspective.</a> Circ Res. 128 (10), 1421-1434 (2021).</li><li>Kosiborod, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+baseline+characteristics+of+step-HFpEF+program+evaluating+semaglutide+in+patients+with+obesity+hfpef+phenotype.">Design and baseline characteristics of step-HFpEF program evaluating semaglutide in patients with obesity hfpef phenotype.</a> JACC Heart Fail. 11 (8), 1000-1010 (2023).</li><li>Borlaug, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+management+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).</li><li>Badrov, M. B., Mak, S., Floras, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+autonomic+disturbances+in+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Cardiovascular autonomic disturbances in heart failure with preserved ejection fraction.</a> Can J Cardiol. 37 (4), 609-620 (2021).</li><li>Wu, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+adipose+deposition+and+the+development+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Myocardial adipose deposition and the development of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Eur J Heart Fail. 22 (3), 445-454 (2020).</li><li>Hahn, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+expression+signatures+in+human+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Myocardial gene expression signatures in human heart failure with preserved ejection fraction.</a> Circulation. 143 (2), 120-134 (2021).</li><li>Korolenko, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-stage+atherosclerosis+in+poloxamer+407-induced+hyperlipidemic+mice:+Pathological+features+and+changes+in+the+lipid+composition+of+serum+lipoprotein+fractions+and+subfractions.">Early-stage atherosclerosis in poloxamer 407-induced hyperlipidemic mice: Pathological features and changes in the lipid composition of serum lipoprotein fractions and subfractions.</a> Lipids Health Dis. 15, 16 (2016).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopontin+and+ldlr+are+upregulated+in+hearts+of+sudden+cardiac+death+victims+with+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+and+diabetes+mellitus.">Osteopontin and ldlr are upregulated in hearts of sudden cardiac death victims with heart failure with preserved ejection fraction and diabetes mellitus.</a> Front Cardiovasc Med. 7, 610282 (2020).</li><li>Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+driven+by+hyperlipidemia+and+enhanced+cardiac+low-density+lipoprotein+receptor+expression.">Mouse model of heart failure with preserved ejection fraction driven by hyperlipidemia and enhanced cardiac low-density lipoprotein receptor expression.</a> J Am Heart Assoc. 11 (17), e027216 (2022).</li><li>Colly, A., Marquette, C., Courtial, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer/poly(ethylene+glycol)+self-healing+hydrogel+for+high-precision+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogel.">Poloxamer/poly(ethylene glycol) self-healing hydrogel for high-precision freeform reversible embedding of suspended hydrogel.</a> Langmuir. 37 (14), 4154-4162 (2021).</li><li>Kanashiro-Takeuchi, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+in+a+murine+model+of+cardiometabolic+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Efficacy of a growth hormone-releasing hormone agonist in a murine model of cardiometabolic heart failure with preserved ejection fraction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 324 (6), H739-H750 (2023).</li><li>Dulce, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+ameliorates+the+myocardial+pathophysiology+characteristic+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Synthetic growth hormone-releasing hormone agonist ameliorates the myocardial pathophysiology characteristic of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3586-3601 (2023).</li><li>Borlaug, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+New+insights+and+pathophysiological+targets.">Obesity and heart failure with preserved ejection fraction: New insights and pathophysiological targets.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3434-3450 (2023).</li><li>Noll, N. A., Lal, H., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+heart+failure+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction.">Mouse models of heart failure with preserved or reduced ejection fraction.</a> Am J Pathol. 190 (8), 1596-1608 (2020).</li><li>Guarnieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considering+the+risks+and+safety+of+intraperitoneal+injections.">Considering the risks and safety of intraperitoneal injections.</a> Lab Anim (NY). 45 (4), 131 (2016).</li></ol>

JH, Miami Üniversitesi ve Gazi İşleri Departmanına atanan GHRH analogları üzerindeki patentlerde ortak mucit olarak listelenmiştir. JH daha önce, bu çalışmada kullanılan fikri mülkiyetin lisans sahibi olan Biscayne Pharmaceuticals'ta öz sermayeye sahipti. Biscayne Pharmaceuticals bu çalışma için fon sağlamadı. JH, kardiyak hücre bazlı tedavi için bir patente sahip olduğunu bildirdi. Vestion Inc.'de hisse sahibidir ve Vestion Inc. ile danışman ve Yönetim Kurulu ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesi olarak profesyonel bir ilişki sürdürmektedir. JH, Longeveron'un Baş Bilim Görevlisi, ücretli danışmanı ve danışma kurulu üyesidir ve Longeveron'da hisse sahibidir. JH aynı zamanda Longeveron'a lisanslı fikri mülkiyetin ortak mucididir. Longeveron LLC ve Vestion Inc. bu çalışmanın finansmanında yer almadı. JH'nin ilişkileri Miami Üniversitesi ile açıklanır ve bir yönetim planı yürürlüktedir.

Son on yılda HFpEF prevalansındaki istikrarlı artışa rağmen, altta yatan patofizyolojinin somut bir şekilde anlaşılması zor olmaya devam etmektedir13. Ayrıca, bugün itibariyle, sınırlı kanıta dayalı tedavi mevcuttur13. Kardiyo-metabolik HFpEF ile ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir. Daha önce, ne kronik böbrek hastalığı (KBH) ne de kardiyak LDLR OE ve p407 enjeksiyonlarının neden olduğu hipertansiyon ile HFpEF'i taklit eden bir hiperlipidemik fare modeli tanıtılmıştı9. 
Bulgular, kardiyak LDLR OE ve hiperlipidemi kombinasyonunun, daha önce yayınlandığı gibi, dört hafta sonra farelerde diyastolik disfonksiyon, aritmiler, sol ventrikül (LV) hipertrofisi, egzersiz intoleransı, kardiyak lipid birikimi ve fibroz ile sonuçlandığını ortaya koydu9. Bu farelerin kalplerinde, karaciğer ve iskelet kaslarında LDL-kolesterol alımında bir artış ve kalplerde ve karaciğerde trigliseritlerde azalma da gözlenmiştir9. Bu yöntemin avantajı, gelişmesi için 16 ve 20 haftaya kadar süren yüksek yağlı diyet (HFD) gibi diğer hiperlipidemik HFpEF fare modellerine kıyasla iyi anlaşılmayan kardiyo-metabolik sendrom yolaklarını araştırma hızındadır14. Bu modelin gelişmesi dört hafta sürer ve insanlarda metabolik anormallikleri taklit eder. Bu nedenle, bu modelin tekrarlanabilirliği esastır. 
AAV9-cTnT-LDLR ve P-407'nin kapsamlı bir şekilde hazırlanmasını ve uygulanmasını sağlamak zorunludur. Bu modelin tekrarlanabilirliği, büyük ölçüde P-407 ve AAV9-cTnT-LDLR konsantrasyonlarının ve dozlarının doğru hesaplamalarına ve ayrıca ağırlık ölçümlerine bağlıdır. Aynı derecede önemli olan, çözelti preparatları ve uygun intravenöz ve intraperitoneal enjeksiyon teknikleridir. Bu tekniklerdeki sapmalar önemli değişikliklere ve istenmeyen sonuçlara neden olabilir. 
Bu modelin etkinliğine ve verimliliğine rağmen, çeşitli sınırlamalar mevcuttur. İntravenöz ve intraperitoneal enjeksiyonları gerçekleştirmek için sıkı bir eğitim gereklidir. Ek olarak, intravenöz ve sık intraperitoneal enjeksiyonlarla ilişkili potansiyel bir morbidite ve mortalite riski vardır. İntravenöz enjeksiyonlar yapılırken fare kuyruğu yaralanmaları meydana gelebilirken, intraperitoneal enjeksiyonlarda çekum delinmesi meydana gelebilir ve bu da peritonite yol açabilir15. Bu yaralanmalar tipik olarak yanlış tekniklerden kaynaklanır ve deney deneklerinin ve tedavinin kaybedilmesine neden olabilir. Bu nedenle, bu prosedürleri gerçekleştirmeden önce kapsamlı bir eğitim gereklidir. Diğer bir sınırlama, bu modelin 129J gerilimine odaklanmasıdır. 129J suşunun seçiminin ardındaki mantık, başlangıçta yayınlanmamış araştırmalarda incelediğimiz C57BL / 6 farelerine kıyasla bu suşta daha hızlı diyastolik disfonksiyon ve HFpEF bulguları veren ön çalışmalardan kaynaklanmaktadır.
Bu sınırlamalardan bağımsız olarak, bu model HFpEF'de yer alan altta yatan mekanizmalar ve potansiyel etkili tedavi seçenekleri hakkında daha hızlı araştırmalara izin verecektir. Önceki çalışmalar, 5-15 hafta boyunca kardiyometabolik HFpEF ile indüklenen HFD ve N [w] -nitro-l-arginin metil ester (L-NAME) için patofizyolojik bir modelin geliştirilmesine yol açmıştır13. Bununla birlikte, HFpEF prevalansındaki sürekli artış nedeniyle, kardiyometabolik HFpEF'in patofizyolojisinin daha iyi anlaşılmasına ve etkili tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır. Kardiyak LDLR OE ve p407 ile indüklenen hiperlipideminin bu fare modeli, gelecekteki araştırma çabaları için kardiyometabolik HFpEF'i indüklemenin hızlı ve uygulanabilir bir yöntemidir.

Korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliği, çoklu komorbiditelerin eşlik ettiği kardiyometabolik bir sendromu ifade eder ve tüm kalp yetmezliği vakalarının %50'sinden fazlasını oluşturur 1,2. Ayrıca, HFpEF sıklığı son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır3. Sınırlı tedavi seçenekleri ile HFpEF, çok yönlü patofizyolojisi göz önüne alındığında, kardiyovasküler hastalıkta karşılanmamış en önemli tıbbi gerekliliği temsil etmektedir4. Bu nedenle, etkili tedaviler geliştirmek için HFpEF'in altında yatan mekanizmaların ve patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için acil bir ihtiyaç vardır.
Son yıllardaki önemli gelişmelere rağmen, lipotoksisiteye atfedilen HFpEF patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. HFpEF'li hastaların, azalmış ejeksiyon fraksiyonu (HFrEF) olan kalp yetmezliği olanlara ve sağlıklı kontrollere kıyasla kayda değer miyokardiyal lipid birikimi sergilediği tespit edilmiştir5. Kardiyak biyopsilerden elde edilen RNA dizileme verileri, HFpEF grubunda sağlıklı ve HFrEF hastalarına kıyasla lipoprotein lipaz (LPL) geninin aşağı regülasyonunu gösterdi6. Poloksamer-407 (P-407), LPL'yi bloke ederek ve ardından plazma trigliseritlerini ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterolü artırarak hiperlipidemiyi indükleyen bir blok kopolimerdir7. Önceki çalışmalar, HFpEF farelerinin kalplerinde yüksek LDL-Reseptör (LDLR) ekspresyonu göstermiştir8. 
Bu bulgulara dayanarak ve kardiyo-metabolik HFpEF'i doğru bir şekilde taklit eden hayvan modellerine olan acil ihtiyacı kabul ederek, hiperlipidemiye bağlı bir murin modeli geliştirildi ve sunuldu. Bu model, açıkça metabolik sendromun yanı sıra lipotoksisitenin katılımına odaklanan HFpEF'i keşfetmek için uyarlanmıştır. Hiperlipidemi / LPL blokajı ve gelişmiş kardiyak LDLR ekspresyonu ile indüklenen bu model, WT-129 farelerinde, tek bir intravenöz (i.v.) adeno-ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR) enjeksiyonu ile birlikte iki haftada bir intraperitoneal (ip) P-407 enjeksiyonları yoluyla kurulmuştur9.
Tedaviden 4 ila 8 hafta sonra, ekokardiyografi, kan basıncı kayıtları, tüm vücut pletismografisi (WBP), sürekli elektrokardiyografi (EKG) telemetrisi, aktivite tekerleği izleme (AWM) ve ayrıca biyokimyasal ve histolojik analizleri kapsayan kapsamlı bir dizi değerlendirme yapıldı9. Dört haftada, LDLR / P407 veya "çift tedavi" fareleri, diyastolik disfonksiyon, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ve artmış sol ventrikül duvar kalınlığı9 dahil olmak üzere farklı HFpEF özellikleri sergiledi. Ek olarak, EKG telemetrisi ve AWM sırasıyla kalp bloklarını ve azalmış aktiviteyi ortaya çıkardı. Özellikle, kan basıncı ve böbrek fonksiyonu normal kaldı9. Sekiz haftaya kadar, diyastolik fonksiyon kötüleşti ve WBP ölçümleri solunum hızlarının azaldığını ortaya çıkardı9. 
Çift tedavi modelinin daha fazla araştırılması, fibrozis, yüksek ıslak / kuru akciğer oranları ve kalp ağırlığı / vücut ağırlığı oranlarını ortaya çıkardı9. Nekropsi asit, kardiyak iskemi ve ksantelazmayı ortaya çıkardı. Şaşırtıcı bir şekilde, tedaviden 6 ila 12 hafta sonra ani ölümler belgelenmiştir9. Bu murin hiperlipidemi güdümlü HFpEF modeli, lipotoksisite aracılı HFpEF ile diyastolik disfonksiyona katkıda bulunan metabolik sendromun karmaşıklıklarını çözmek için hızlı, değerli ve umut verici bir deneysel araç sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)</td>
			<td>U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)</td>
			<td></td>
			<td>Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400&#160;</td>
			<td>(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>Vevo 2100 or 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn Animal Health, Inc.</td>
			<td>NDC: 59399-106-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart&#160; software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Pro version 8.1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV catheter</td>
			<td>Millar Instrument</td>
			<td>PVR 1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound analysis software&#160;</td>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type (WT) mice on 129J background&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of hyperlipidemia&#45;induced heart failure with preserved ejection fraction

Lipotoksisite tarafından yönlendirilen korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliğinin patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. Kardiyo-metabolik HFpEF'i doğru bir şekilde taklit eden hayvan modellerine olan acil ihtiyaç göz önüne alındığında, HFpEF hastalarında görülen tersine mühendislik fenotipleri ile hiperlipidemiye bağlı bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu model, lipotoksisite ve metabolik sendrom arasındaki etkileşime odaklanarak HFpEF'i araştırmayı amaçladı. Hiperlipidemi, lipoprotein lipazı bloke eden bir blok kopolimer olan poloksamer-407'nin (P-407) iki haftalık intraperitoneal enjeksiyonları yoluyla 129J suş arka planında vahşi tip (WT) farelerde indüklendi, adeno-ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörünün (AAV9-cTnT-LDLR) tek bir intravenöz enjeksiyonu ile birleştirildi. Tedaviden 4 ila 8 hafta sonra ekokardiyografi, kan basıncı kaydı, tüm vücut pletismografisi, ekokardiyografi (EKG) telemetrisi, aktivite tekerleği izleme (AWM) ve biyokimyasal ve histolojik analizler dahil olmak üzere kapsamlı değerlendirmeler yapıldı. LDLR / P-407 fareleri, diyastolik disfonksiyon, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ve artmış sol ventrikül duvar kalınlığı dahil olmak üzere dört haftada ayırt edici özellikler sergiledi. Özellikle, kan basıncı ve böbrek fonksiyonu normal aralıklarda kaldı. Ek olarak, EKG ve AWM sırasıyla kalp blokları ve azalmış aktivite ortaya çıkardı. Diyastolik fonksiyon sekiz haftada kötüleşti ve solunum hızlarında önemli bir düşüş oldu. Çift tedavi modeliyle ilgili daha fazla araştırma, yüksek fibroz, ıslak / kuru akciğer oranları ve kalp ağırlığı / vücut ağırlığı oranlarını ortaya çıkardı. LDLR / P-407 fareleri ksantelazmalar, asitler ve kardiyak iskemi sergiledi. İlginç bir şekilde, ani ölümler tedaviden 6 ila 12 hafta sonra meydana geldi. Murin HFpEF modeli, lipotoksisite aracılı HFpEF bağlamında diyastolik disfonksiyona katkıda bulunan metabolik sendromun karmaşıklıklarını aydınlatmak için değerli ve umut verici bir deneysel kaynak sunmaktadır.

Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) denotes a cardiometabolic syndrome accompanied by multiple comorbidities and constitutes over 50% of all heart failure cases1,2. Moreover, the frequency of HFpEF has steadily risen over the past decade3. With limited treatment options, HFpEF represents the most significant unmet medical necessity in cardiovascular disease, given its multifaceted pathophysiology4. Thus, an urgent need exists to enhance comprehension of the underlying mechanisms and pathophysiology of HFpEF to develop effective therapies.
Despite significant advancements in recent years, the pathophysiology of HFpEF attributed to lipotoxicity remains incompletely understood. It is established that patients with HFpEF exhibit notable myocardial lipid accumulation compared to those with heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) and healthy controls5. RNA sequencing data from cardiac biopsies showed downregulation of the lipoprotein lipase (LPL) gene in the HFpEF group compared to the healthy and HFrEF patients6. Poloxamer-407 (P-407) is a block co-polymer that induces hyperlipidemia by blocking LPL and subsequently increasing plasma triglycerides and low-density lipoprotein (LDL) cholesterol7. Previous studies demonstrated high LDL-Receptor (LDLR) expression in the hearts of HFpEF mice8. 
Building upon these findings and recognizing the pressing need for animal models accurately mimicking cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed and presented. This model was tailored to explore HFpEF, explicitly focusing on the involvement of lipotoxicity alongside metabolic syndrome. Induced by hyperlipidemia/LPL blockade and enhanced cardiac LDLR expression, this model was established in WT-129 mice on 129J background through biweekly intraperitoneal (i.p.) injections of P-407 combined with a single intravenous (i.v.) injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)9.
Between 4 and 8 weeks post-treatment, an extensive array of assessments was conducted, encompassing echocardiography, blood pressure recordings, whole-body plethysmography (WBP), continuous electrocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), as well as biochemical and histological analyses9. At four weeks, the LDLR/P407 or "double treatment" mice exhibited distinct HFpEF features, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness9. Additionally, ECG telemetry and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Notably, blood pressure and renal function remained normal9. By eight weeks, diastolic function deteriorated, and WBP measurements unveiled reduced respiratory rates9. 
Further exploration of the double treatment model revealed fibrosis, elevated wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios9. Necropsy revealed ascites, cardiac ischemia, and xanthelasmas. Intriguingly, sudden deaths were documented between 6 and 12 weeks post-treatment9. This murine hyperlipidemia-driven HFpEF model provides a rapid, valuable, and promising experimental tool for unraveling the complexities of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction with lipotoxicity-mediated HFpEF.

Yazar Spotlight: Lipotoksisite ve HFpEF Arasındaki İlişkiyi Keşfetmek 

Korunmuş Ejeksiyon Fraksiyonu ile Hiperlipidemiye Bağlı Kalp Yetmezliğinin Murin Modeli

Our research aims at examining heart failure with preserved ejection fraction, known as HFpEF, specifically investigating the effects of lipotoxicity. We seek to elucidate the intricate relationship between metabolic syndrome and lipotoxicity in driving HFpEF progression and uncover the underlying mechanisms driving HFpEF pathophysiology using this experimental murine model. Despite the rising prevalence and limited treatment options for HFpEF, its pathophysiological mechanisms mainly related to metabolic syndrome remain poorly understood.This model presents a unique opportunity to bridge this gap and potentially develop new therapies for HFpEF. Our model's most important advantage is its ability to mimic significant lipid mishandling observed in HFpEF patients. This mouse model offers valuable insights into the pathophysiology of HFpEF, especially cardiac metabolism.Our findings underscore the importance of fatty acid and cholesterol mishandling in cardiometabolic HFpEF. This model perfectly shows how fatty acid deprivation disrupts metabolism at different levels. It provides researchers with potential avenues to discover novel traps for HFpEF patients.Here at the Shahada Laboratory, we will focus on translating this model into large animals. We will investigate questions related to the pathogenesis, sudden death, and potential therapeutic interventions targeting lipotoxicity, inflammation, and cardiac remodeling.

4 haftalık kombine tek doz iv sonra. AAV9-cTnT-LDLR ve iki haftalık i.p. P-407 enjeksiyonları, ekokardiyografide korunmuş ejeksiyon fraksiyonu, uzamış intraventriküler gevşeme süresi (IVRT) ve E/E' ve azalmış E/A ile kanıtlandığı gibi HFpEF ortaya çıktı (Şekil 3A-E). 4 hafta sonraki verilerle karşılaştırıldığında 8 hafta sonra daha kötü diyastolik disfonksiyon gözlendi. 8 haftalık tedaviden sonra basınç-hacim (PV) döngü analizi, diyastolik disfonksiyonun ekokardiyografi bulgularını doğrulayan artmış bir diyastol sonu basınç-hacim ilişkisi eğimi gösterdi (Şekil 3F). Özellikle, LDLR / P-407 ile tedaviden 6 ila 12 hafta sonra LDLR / P-407 ile tedavi edilen önemli sayıda farede ani ölüm meydana geldi (Şekil 3G). Bu sonuçlar, bu protokolün ve deneysel tasarımın etkinliğini doğrulayan kardiyo-metabolik HFpEF'i göstermektedir. LDLR / P407 ile tedavi edilen farelerde, yüksek toplam kolesterol, trigliseritler, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterol ve normal yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol seviyeleri ile kanıtlandığı gibi, 4 ve 8. haftalarda hiperlipidemi kaydedilmiştir ve hiperlipidemi bulgularımızı doğrulamaktadır (Şekil 3H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig01.jpg"> Resim 1: AAV9-cTnT-LDLR için plazmid haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig02v2.jpg"> Şekil 2: Enjeksiyon prosedürleri. (A) 129J suş arka planında WT faresinde AAV9-cTnT-LDLR'nin intravenöz (iv) kuyruk veni enjeksiyonunu gösteren temsili resim. (B) Daha önce tek i.v. AAV9-cTnT-LDLR dozu ile muamele edilmiş 129J suş arka planında WT faresinde P-407'nin intraperitoneal enjeksiyonunun gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig02largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig03.jpg"> Şekil 3: Tedavi edilmeyen farelere kıyasla 4 (n = 17) ve 8 hafta (n = 11) LDLR / P-407 tedavisinden sonra korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliğini gösteren kardiyokardiyografi parametreleri (n = 15). Bu, diyastolik disfonksiyonun tüm göstergeleri olan korunmuş ejeksiyon fraksiyonu, uzamış izovolumik gevşeme süresi (IVRT), artmış E/E' ve azalmış E/A ile kanıtlanır. (F) Basınç-hacim döngüsü edinimi ve analizleri, 8 haftalık tedaviden sonra diyastol sonu basınç-hacim ilişkisi (EDPVR) eğiminin arttığını ortaya çıkardı. (G) LDLR / P-407 ile tedaviden 6 ila 12 hafta sonra ani ölüm meydana geldi. (H) Bir lipid paneli, LDLR / P407 ile tedavi edilen farelerde 4 (n = 4) ve 8 haftada (n = 3) yüksek toplam kolesterol, trigliseritler, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterol ve tedavi edilmemiş farelere (n = 5) kıyasla normal yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol seviyeleri. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF at JoVE.com

Bu protokol, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile hiperlipidemiye bağlı kalp yetmezliğinin bir murin modelini çoğaltmak için ayrıntılı bir yaklaşım sunar. Tasarım, adeno ile ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (AAV9-cTnT-LDLR) ve poloksamer-407'nin (P-407) uygulanmasını birleştirir.

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Araştırmamız, özellikle lipotoksisitenin etkilerini araştırmak için HFpEF olarak bilinen korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ile kalp yetmezliğini incelemeyi amaçlamaktadır. Bu deneysel murin modelini kullanarak HFpEF ilerlemesini yönlendirmede metabolik sendrom ve lipotoksisite arasındaki karmaşık ilişkiyi aydınlatmaya ve HFpEF patofizyolojisini yönlendiren altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmaya çalışıyoruz. HFpEF prevalansının artmasına ve tedavi seçeneklerinin sınırlı olmasına rağmen, esas olarak metabolik sendromla ilişkili patofizyolojik mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır.Bu model, bu boşluğu doldurmak ve potansiyel olarak HFpEF için yeni tedaviler geliştirmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Modelimizin en önemli avantajı, HFpEF hastalarında gözlenen önemli lipid yanlış kullanımını taklit etme yeteneğidir. Bu fare modeli, HFpEF'in patofizyolojisi, özellikle kardiyak metabolizma hakkında değerli bilgiler sunar.Bulgularımız, kardiyometabolik HFpEF'de yağ asidi ve kolesterolün yanlış kullanımının önemini vurgulamaktadır. Bu model, yağ asidi yoksunluğunun metabolizmayı farklı seviyelerde nasıl bozduğunu mükemmel bir şekilde göstermektedir. Araştırmacılara HFpEF hastaları için yeni tuzaklar keşfetmeleri için potansiyel yollar sağlar.Burada, Shahada Laboratuvarı'nda, bu modeli büyük hayvanlara dönüştürmeye odaklanacağız. Patogenez, ani ölüm ve lipotoksisite, inflamasyon ve kardiyak yeniden şekillenmeyi hedefleyen potansiyel terapötik müdahalelerle ilgili soruları araştıracağız.

a-murine-model-hyperlipidemia-induced-heart-failure-with-preserved

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

885 Görüntüleme.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine. Araştırmamız, özellikle lipotoksisitenin etkilerini araştırmak için HFpEF olarak bilinen korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ile kalp yetmezliğini incelemeyi amaçlamaktadır. Bu deneysel murin modelini kullanarak HFpEF ilerlemesini yönlendirmede metabolik sendrom ve lipotoksisite arasındaki karmaşık ilişkiyi aydınlatmaya ve HFpEF patofizyolojisini yönlendiren altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmaya çalışıyoruz. HFpEF prevalansının artmasına ve tedavi seçeneklerinin s?...