Bu çalışma, NIH'nin OD hibe R24OD031956 tarafından desteklenmiştir. Yardımları ve destekleri için Samantha Jalbert, Jill Ralston ve Cora Anderson'a ve ayrıca yararlı geri bildirimleri için editörümüz ve anonim hakemlerimize teşekkür ederiz

Tüm deneyler Harvard Tıp Fakültesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) (IS 00001365_3) kural ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Temsili sonuçlar hem perfüze edilmiş hem de perfüze edilmemiş olgun albino erkek Xenopus laevis için gösterilmiştir.
1. Deneysel hazırlık 
NOT: Numune almadan önce perfüzyon protokolü8 takip ediliyorsa, adım 2.2'ye geçin.
<ol><li>Araştırma kurumunun bu protokolde açıklanan ötenazi tekniğini onayladığından emin olun.</li>
	<li>5 g/L MS-222 (trikain metansülfonat) ve 5 g/L sodyum bikarbonattan oluşan bir çözelti hazırlayın (bkz. Hacim, ötenazi yapılan hayvanları tamamen kaplamak için gereken hacimden daha büyük olmalıdır. ≥7 olduğundan emin olmak için pH'ı kontrol edin.</li>
	<li>Xenopus'u ötenazi çözeltisine yerleştirerek birincil ötenazi gerçekleştirin; Hayvan toplam 1 saat su altında kalacaktır.</li>
	<li>Diseksiyon istasyonunu, örneklemeden hemen sonra tüm dokular soğutulmuş PBS veya 0.7x PBS9'da (deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak) durulanabilecek, kontrol edilebilecek ve 5x (veya daha büyük) büyütme ışığı altında kesilebilecek şekilde ayarlayın. Bu istasyon aynı zamanda kullanıcının tüm forsepsleri ve makasları değiştirmesini veya kullanımlar arasında silerek temizlemesini sağlamalıdır.</li>
	<li>Kurbağa 1 saat boyunca çözelti içinde kaldıktan sonra, birincil ötenazi tamamlanmıştır. Kurbağayı çıkarın ve bir ayak çimdikleme yaparak ağrı tepkisi kaybını kontrol edin.</li>
	<li>Tür, tür, cinsiyet, yaş ve sağlık durumu gibi hayvan için uygun ayrıntıların yanı sıra perfüze edilip edilmediğini kaydedin. Xenopus'u tartın ve burun-havalandırma uzunluğu gibi ek ölçümler yapın.</li>
	<li>Kurbağayı sırt üstü yatırın ve vücudun proksimalindeki uzuvları aşağı doğru sabitleyin (Şekil 1).</li>
	<li>Diseksiyon makası kullanarak cildi kesin, orta çizgiye kadar kesin ve ardından yanal olarak iki flep yapın.</li>
	<li>Şekil 2'ye atıfta bulunarak, linea alba'yı tanımlayın ve onu kavramak ve sölomik boşluktan uzaklaştırmak için forseps kullanın. Makas kullanarak kas sistemini dikkatlice kesin. Boşluk duvarından iki kanat açın. Tüm kanatları kesin veya sabitleyin.</li>
	<li>Hala atmakta olan kalbi belirleyin. Kalbe daha iyi erişim sağlamak için korakoid kemikleri küçültmek için diseksiyon makası kullanın (Şekil 2). NOT: Numune almadan önce kalp atmayı durdurduysa, numune tazeliğinin bozulduğuna dikkat edilmelidir.</li>
</ol>2. Örnekleme
NOT: Hayvan perfüze edilmişse, adım 2.2'ye geçin.
<ol><li>İnce perikardı tanımlayın ve doku forseps ile gergin bir şekilde çekin (Şekil 3).</li>
	<li>İridektomi makasının ucunu kullanarak, alttaki dokuları kesmemeye dikkat ederek perikardı nazikçe delin. Perikard'ı kalbin 3 odasından soyun.</li>
	<li>Ventrikülü apeksten kavramak için forseps kullanın, kulak kepçelerine ve arteriyel gövdeye nerede bağlandığını belirleyin (Şekil 4) ve bu ataşmanların altından kesin (Şekil 5). Gerekirse, ventrikülü, kulak kepçelerinden veya arteriyel gövdeden hiçbir doku görünmeyecek ve ventrikül içinde açık renkli kapak dokusu görünmeye devam edecek şekilde kesin. NOT: Perfüze edilmemiş hayvanlarda, ventrikülün çıkarılması ikincil ötenazi olarak nitelendirilebilir.</li>
	<li>Karaciğerin 3 lobu görünür olacaktır (Şekil 6 ve Şekil 7). Sol lobun dudağını (izleyicinin sağında) kavrayın ve karaciğer ve kistik kanallar görünecek şekilde yavaşça kaldırın (Şekil 8). Bu ataşmanların altındaki lobun alt 1 / 3'ünü örnek alın (Şekil 9).</li>
	<li>Dişi bir kurbağanın dokularına daha iyi erişim sağlamak için yumurtalığı çıkarmak faydalı olacaktır. Germinal epitel adı verilen bir viseral periton tabakasıyla sarılmış yumurtalığı tanımlayın. Bağlantı alanını görünür hale getirmek için lobları kendi yanlarına gelene kadar yavaşça kaydırın (Şekil 10). Bu ataşmanlar doğrudan eşleştirilmiş böbreğe ventraldir.</li>
	<li>Makas kullanarak, yumurtalıkları böbreklere zarar vermeden mümkün olduğunca yakın bir şekilde çıkarın (Şekil 11).</li>
	<li>Karaciğerin medial lobunu (ön lob olarak da adlandırılır) inceleyin ve mezenter ve hepatopankreatik kanal (aynı zamanda ortak safra kanalı olarak da adlandırılır) yoluyla mide ve duodenuma nasıl bağlandığını not edin (Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8).</li>
	<li>İridektomi makası kullanarak mezenteri, hepatoduodenal ligamenti ve duodenum ile birleştiği hepatopankreatik kanalı kesin. Pankreas ve hepatopankreatik kanalın karaciğerin medial lobuna bağlantısını keser, böylece koyu renkli karaciğer dokusu bağlanmaz (Şekil 12).</li>
	<li>Dişli forseps ile mideyi ve doku forseps ile pankreasın üst ucunu kavrayın. 5x büyütme altında, pankreası mideden nazikçe uzaklaştırın (Şekil 13). NOT: Temiz bir şekilde çıkmazsa, kalan pankreas dokusu görünür olacak ve parçalar halinde toplanabilir. Alternatif olarak, pankreas iridektomi makası ve doku forsepsleri kullanılarak metodik olarak ayrılabilir.</li>
	<li>Şekil 14A'ya atıfta bulunarak, idrar kesesini tanımlayın ve kloaka mümkün olduğunca yakın keserek çıkarın. Bu dokuyu atın.</li>
	<li>Şekil 14B'ye bakınca, kalın bağırsağı tanımlayın ve kalın bağırsağı kloaka mümkün olduğunca yakın kesmek için gergin bir şekilde çekin. Tüm sindirim kanalını çıkarın ve atın, dalağa bağlandığı yerdeki peritonu kesin. Şişman bedenler artık tamamen erişilebilir olacak.</li>
	<li>Şişman cisimleri kendi taraflarında olacak şekilde ayırın. Şişman cismin karın zarına bağlandığı böbrek üzerindeki alan görünür olacaktır. Sol yağ gövdesinin tabanını (izleyicinin sağında) kavrayın ve böbreğin zarar görmemesi için küçük bir kenar boşluğu bırakarak peritondan kesmek için makas kullanın (Şekil 15).</li>
	<li>Kalan yağ gövdesini çıkarın ve atın. Eşleştirilmiş böbrekler artık tamamen görünür olacaktır.</li>
	<li>Dişi kurbağalarda veya belirgin körelmiş yumurta kanallarına sahip erkeklerde, bir yumurta kanalını kavrayın ve onu böbrek ve kloakadan uzaklaştırın (Şekil 16). Yumurta kanalını kloaka ile birleştiği yerden kesin ve böbrekten uzaklaştırmaya devam edin, belirgin hale geldikçe net peritoneal ekleri kesin. Bu dokuyu atın.</li>
	<li>Bu işlemi kalan yumurta kanalı ile tekrarlayın.</li>
	<li>Böbrekler hala berrak periton (retroperitoneal) ile kaplıdır10. Böbrekleri kavramak için forseps kullanın ve peritonu alt uçlarından kesin.</li>
	<li>Böbreklere zarar vermeden peritonu mümkün olduğunca yakın kesmek için makas kullanarak böbrekleri sölomik boşluktan kaldırın (Şekil 17).</li>
	<li>5x büyütme altında, fazla peritonu ve kalan diğer dokuları (yağ gövdeleri, dalak) kesin. Kurbağa dişiyse, kalan yumurtalık dokusunun çıkarıldığından emin olun (Şekil 18). Kurbağa erkekse, testisi dikkatlice çıkarın ve büyütme olmadan görülemeyen körelmiş bir yumurta kanalı olup olmadığını kontrol edin (Şekil 19).</li>
	<li>Hayvanın pimlerini çıkarın, ventrumunun üzerine çevirin ve hayvanın uzuvlarını yeniden sabitleyin.</li>
	<li>Örnekleme için arka bacaklardan birini seçin ve o uzvun ayağını sabitleyin.</li>
	<li>Gastroknemius/tibiofibula üzerinden badem şeklinde bir deri flebi çıkarın (Şekil 20).</li>
</ol>

Erişkin Xenopus Organları için Standardize Diseksiyon ve Örnekleme Protokolü

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.

Bu protokol tazeliği en üst düzeye çıkarmayı amaçladığından, bazı örneklerde istenmeyen dokular bulunabilir. Örneğin, hepatopankreatik kanal ve bazı mezenterler pankreas ile örneklenir ve bazı periton dokusu, adrenal bezler ve üreterler her zaman eşleştirilmiş böbrekler ile örneklenir.  Tazelik bir endişe kaynağı değilse, modifiye teknikler kullanılarak daha hassas örnekleme elde edilebilir.
Organların görünümü ve yeri, cinsiyetler ve Xenopus türler...

Yetişkin Xenopus'un "dijital diseksiyonu" mevcut olsa da,1, yetişkin Xenopus'un tekrarlanabilir organ ve doku örneklemesi, diğer yetişkin modeller (örneğin fareler 2,3,4) için mevcut olan ayrıntılı talimatlar olmadan zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, larvaları için şu anda mevcut olana benzer şekilde yetişkin Xenopus'un doğru ve tekrarlanabilir organ örneklemesi için net bir rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır5. Maksimum tazeliği korumak ve protokolü tüm kullanıcılar için erişilebilir kılmak için tamamlama kolaylığına vurgu yapılır.
Rana sp.6 için kapsamlı bir diseksiyon kılavuzunun yanı sıra diğer anuranlar7 için çok sayıda sınıf diseksiyon kılavuzu olmasına rağmen, şu anda Xenopus diseksiyon ve örnekleme kılavuzu mevcut değildir. Örnekleme uygulamalarına veya amfibi anatomisine aşina olmayanlar için, Xenopus ve diğer anuranlar arasındaki küçük farklılıklar, bu kaynakları tekrarlanabilir doku örneklemesi için yetersiz hale getirir.
Bu kılavuzda pek çok değerli doku dahil edilmemiştir ve hatta atılmıştır; Bu doku tazeliğini sağlamak içindir. Altı örnek, kullanıcının deneyimi veya beceri düzeyi ne olursa olsun, bu dokuların kalp atmaya başladıktan sonra bir saatten kısa sürede toplanabilmesini sağlayacak kadar sınırlıdır. Diğer birçok dokuyu toplamak için daha gelişmiş ve ayrıntılı kılavuzlar, ayrı tamamlayıcı makaleler olarak hazırlanmaktadır.
Daha az deneyimli kullanıcılar için, bu protokolün, değiştirilmesi zor olan herhangi bir hayvanı (yani, transgenikler, ileri yaştaki hayvanlar, vb.) örneklemeden önce, deney dışındaki nedenlerle ötenazi yapılan hayvanlar üzerinde denenmesi her zaman önerilir. İdeal olarak, örneklenen tüm hayvanlar sağlıklı olacak ve eğer dişiyse, son iki hafta içinde yumurtlanmamış olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus , yüz yılı aşkın bir süredir omurgalı gelişimini ve hastalıklarını anlamak için güçlü bir model organizma olmuştur. Embriyonun deneysel analizi ve diseksiyon teknikleri iyi belgelenmiş olsa da, yetişkin Xenopus yapılarının ve organlarının tanımları, yetişkinlerle çalışma teknikleriyle birlikte, kantitatif proteomik ve tek hücreli transkriptomik gibi modern yaklaşımların gereksinimlerini dikkate alacak şekilde güncellenmemiştir. Hücre tipi ve gen merkezli bakış açıları, embriyonik aşamalarda yetişkin dokulardakilerle zıt gözlemler gerektirir. Larva organları, larvadan yetişkine geçiş boyunca, özellikle büyük metamorfoz yeniden şekillenmesi sırasında, genel yapılarında, morfolojilerinde ve anatomik konumlarında önemli değişikliklere uğrar. Organ tanımlama ve diseksiyon için sağlam standartlar oluşturmak, farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen veri kümelerinin tutarlı olmasını sağlamak için çok önemlidir. Bu protokol, yetişkin Xenopus'taki altı organı tanımlayarak, yetişkin Xenopus'un kalp ventrikülü, karaciğer, yağ gövdesi, pankreas, eşleştirilmiş böbrek ve cildin diseksiyonu ve örneklenmesi için yöntemleri göstermektedir. Koruma yöntemlerine bağlı olarak, diseke edilen organlar kantitatif proteomik, tek hücreli/çekirdekli transkriptomik, in situ hibridizasyon, immünohistokimya, histoloji vb. için kullanılabilir. Bu protokol, doku örneklemesini standardize etmeyi ve erişkin organ sistemlerinin çok laboratuvarlı araştırmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Şekil 1'den Şekil 20'ye kadar kullanılarak ve bu protokolün tüm adımlarını izleyerek, kalp ventrikülü, karaciğerin sol lobu, pankreas, sol yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve bir deri flebi ötenaziden sonraki bir saat içinde temiz bir şekilde eksize edildi. Bu süre içinde numuneler, Şekil 21'de gösterildiği gibi görünecek şekilde durulanır ve kesilir.
<p class="jove_content b=iglegend" fo:keep-t...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Standardizing Tissue Sampling in Proteomics and Immunochemistry Research at JoVE.com

Yazar Spotlight: Proteomik ve İmmünokimya Araştırmalarında Doku Örneklemesinin Standardizasyonu

Bu makale, yetişkin Xenopus'ta hızlı ve kolay bir şekilde erişilebilen altı önemli ve çeşitli organı örneklemek için bir kılavuz sunmaktadır: kalp ventrikülü, karaciğer lobu, pankreas, yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve cilt.

Erişkin Xenopus'ta Altı Önemli Organı Hızlı Örnekleme Teknikleri

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Bu çalışmadan önce, hızlı amfibi perfüzyonu için bir protokol geliştirdim. Bu protokol, dokularda aşırı miktarda kan bulunmasının istenmediği proteomik ve immünokimya gibi araştırmalar için numune almadan önce kullanılmalıdır. Mevcut birçok diyagram ve diğer yardımcı araçlar olmasına rağmen, şu anda yetişkin ksenopustan dokuların hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl çıkarılacağına dair kapsamlı bir kılavuz bulunmamaktadır.Standartlaştırılmış örnekleme tekniklerine sahip olmanın, laboratuvarların dokuları kolayca paylaşmasına olanak sağlayacağını umuyoruz. Bu, özellikle biyogüvenlik endişeleri veya nakliye kısıtlamaları nedeniyle hayvanların ithalat ve ihracatının mümkün olmadığı durumlarda avantajlıdır.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

813 Görüntüleme.  Harvard Medical School. Bu çalışmadan önce, hızlı amfibi perfüzyonu için bir protokol geliştirdim. Bu protokol, dokularda aşırı miktarda kan bulunmasının istenmediği proteomik ve immünokimya gibi araştırmalar için numune almadan önce kullanılmalıdır. Mevcut birçok diyagram ve diğer yardımcı araçlar olmasına rağmen, şu anda yetişkin ksenopustan dokuların hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl çıkarılacağına dair kapsamlı bir kılavuz bulunmamaktadır.Standartlaştırı...

Video: Yazar Spotlight: Proteomik ve İmmünokimya Araştırmalarında Doku Örneklemesinin Standardizasyonu

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Biyoloji

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Kobaylardaki Sigara Terminal Kan Örnekleme Teknikleri

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.