Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
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Este trabalho recebido financiamento do centro alemão para pesquisa de infecção (DZIF), TTU hepatite projetos 5.807 e 5.704, a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15) e o centro australiano para HIV e hepatite Virology Research.
Estamos em dívida com o Professor William Mason por sua parte em desenvolver o método de invPCR original e demonstrando para nós. Gostaríamos de agradecer os Drs Yi Ni e Florian A. Lempp para reagentes (linhas de célula e inóculo HBV). Reconhecemos a Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt e Dr. Katrin Schöneweis para obter assistência técnica. Estamos gratos, Miriam Kleinig para revisão e professores Nicholas Shackel e Ralf Bartenschlager para suporte contínuo.

1. infecção e extração de DNA de células
<ol><li>Manter o culto Huh7-NTCP células8,9 em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% v/v fetal de soro bovino, 1 x penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina. Nota: Isto anteriormente tem sido relatado em detalhe40.</li>
	<li>Semente de 2 x 105 células/mL Huh7-NTCP as células em uma placa de 12 com 1 mL de DMEM.</li>
	<li>Se testar tratamentos de célula (por exemplo, inibidores HBV), aplicá-las para a sobrenadante de cultura 4h após a semeadura (1 dia antes da infecção pelo VHB). Para um controle negativo, aplicar 200 nM Myrcludex B (um potente HBV entrada inibidor41).</li>
	<li>Usar o sobrenadante de42 heparina-coluna purificado do HepAD3843 inocular um para infectar células em 1.000 VGE/celular em 500 µ l do meio de cultura (DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% v/v, 1 x 2 mM L-glutamina, penicilina/estreptomicina e 2,5% v/v DMSO), contendo 4% w/v polietilenoglicol 8000 [dissolvido em 1x tampão fosfato salino (PBS)].</li>
	<li>Cultura de células em uma incubadora de 37 ° C (fixado em 5% CO2 e 90% de umidade).</li>
	<li>Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS estéril 1 x a pós-infecção 16 – 24 h.</li>
	<li>Substitua os meios de cultura em 2 dias após a infecção pelo VHB até a colheita.</li>
	<li>A pós-infecção dia 3, tratar as células com 5 µM Tenofovir disoproxil e 10 µM lamivudina para limitar a produção de intermediários HBV replicative que são ampliáveis por invPCR.</li>
	<li>A pós-infecção dia 5, trypsinize as células com 200 µ l de Trypsin-EDTA e Resuspenda-los em 2 mL de DMEM (suplementado com soro bovino fetal de 10% v/v, 1 x penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina), que também contém 5 µM Tenofovir disoproxil e 10 µM Lamivudina.</li>
	<li>Transferi as suspensões celulares de uma placa de 6 para induzir uma rodada de mitose (que tem sido relatada para induzir perda de HBV cccDNA44 e outros intermediários de HBV DNA que são ampliáveis por invPCR).</li>
	<li>A pós-infecção dia 7, trypsinize as células expandidas em 400 µ l de Trypsin-EDTA e ressuspender a mistura em 1 mL de DMEM. Coloque a suspensão em um tubo de 1,5 mL, as células de pelotas por centrifugação a 500 x g durante 5 min e retire o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>(Opcional) Armazene as pelotas de célula a-20 ° C até que estejam prontos para a extração de DNA.</li>
	<li>Extrai o DNA do centrifugado usando um kit de extração de DNA, conforme as instruções do fabricante. Estime a concentração final de DNA utilizando densitometria óptica. Nota: O rendimento de DNA em um volume de eluição de 100 μL é geralmente ~ 250-400 ng/μL.</li>
</ol>2. inversão do DNA
<ol><li>Extraia o ~1.5–2.5 alíquota μg do DNA total da etapa 1 em um tubo PCR 200 μL. Adicionar a quantidade apropriada de enzima de restrição mestre-mistura para resultar em um volume de reação de 40 μL contendo digerir tampão de reação 1x (EG., buffer de CutSmart) e 10 U Ncoeu-HF.</li>
	<li>Homogeneizar as reações e spin para baixo em uma centrífuga de tubo pequeno. Incube a reação de enzima de restrição em uma máquina PCR, a 37 ° C por 1h para eficiência óptima digestão.</li>
	<li>Inativar a enzima de restrição incubando a 80 ° C por 20 min.</li>
	<li>Transferi a reacção de toda restrição enzimática para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 400 μL de T4 DNA ligase buffer e 500 U de T4 DNA ligase de 1x e misturá-lo completamente. O volume de reação grande incentiva intra molecular (em oposição a inter molecular) ligadura dos fragmentos do DNA digeridos.</li>
	<li>Incube a reação de ligadura em temperatura ambiente por 2 h garantir a completa da ligadura.</li>
	<li>Inativar o T4 DNA ligase a 70 ° C por 20 min.</li>
	<li>Adicione 10 μL de 10% p/v Dodecil sulfato de sódio para garantir a completa inactivação do T4 ligase.</li>
	<li>Misturar os tubos vortexing de pulso e brevemente spin para baixo a mistura de reação. Adicione NaCl a uma concentração final de 100 mM e dextran (35-45 kDa) a uma concentração final de 90 µ g/mL. Misturar os tubos vortexing de pulso e brevemente spin para baixo a mistura de reação.</li>
	<li>Adicione 900 μL de etanol 100% e misture por inversão. Precipitar o DNA a-20 ° C durante a noite.</li>
	<li>Pellet de DNA precipitado por centrifugação a 14.000 x g, durante 15 min. Retire o sobrenadante por aspiração com uma pipeta P200. Lave o pellet com 500 μL de etanol a 70% v/v e centrifugação a 14.000 x g, durante 15 min.</li>
	<li>Remova o etanol por aspiração com uma pipeta P200. Secar o sedimento de DNA em temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Dissolva a pelota em 20 μL de H2O. Adicionar 20 μL de enzima de restrição mestre-mistura para resultar em um volume de reação de 40 μL contendo digerir tampão de reação 1x, 5 U da BsiHKAI e 5 U de Spheu-HF incubar a reação de enzima de restrição em um calor-bloco a 37 ° C (a temperatura ideal para Sph-HF) por 1h.</li>
	<li>Brevemente spin para baixo a mistura de reação. Incube a reação de enzima de restrição em um calor-bloco a 65 ° C (a temperatura ideal para BsiHKAI) por 1h.</li>
	<li>Brevemente spin para baixo a mistura de reação.</li>
	<li>Armazene o DNA invertido a-20 º C até o próximo passo.</li>
</ol>3. aninhado PCR
<ol><li>Remover potenciais amplicons de um selo de esteira de silicone reutilizável usando uma solução de degradação do DNA, lave o tapete com água livre de DNA e secá-lo à temperatura ambiente enquanto se prepara a mistura PCR.</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de uma mistura de x PCR 1 contendo o exterior para a frente (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') e reversa (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') as primeiras demão em uma concentração de 0,5 µM.</li>
	<li>Adicione 170 μL da 1 mistura x PCR poços A1 e E1 em um prato PCR de 96 poços.</li>
	<li>Adicione 120 μL da 1 mistura x PCR poços B1 a H1.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de DNA invertido da etapa 2 poços A1 e E1 (2 diferentes amostras invertidas podem ser analisadas no mesmo prato PCR). Mistura da reação em cada poço pipetando suavemente cada um com cerca de 10 vezes usando um P1000 definido como 100 μL.</li>
	<li>Amostras diluídas em série de poços de A1 a D1 na proporção de 1:3 Transferindo 60 μL em cada etapa. Misture os poços em cada etapa pipetando-los delicadamente sobre 10 vezes usando um P1000 definido como 100 μL. Evite a formação de bolhas. Repita a etapa 3.6 para bem E1, diluindo até bem H1.</li>
	<li>Alíquota 10 μL da mistura de reação usando uma pipeta multicanal de poços A1-H1 em poços A2-H2, H3-A3, e assim por diante até chegar à A12-H12 de poços da placa de 96 poços. Cobrir a placa PCR com a esteira de silicone seco da etapa 3.1, pressionando firmemente.</li>
	<li>Colocar a placa em uma máquina PCR e executar o programa a seguir: 10 min a 95 ° C; 35 ciclos de 15 s a 95 ° C, 15 s a 54 ° C e 3 min a 72 ° C; 7 min a 72 ° C; Então, segure a placa na temperatura de quarto.</li>
	<li>Aqueça os pinos de um replicador de 96 pinos para quente com um bico de Bunsen e em seguida esfriar pelo menos 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Encher os poços de uma segunda placa PCR com 10 μL de 1 mistura de x PCR (contendo um amortecedor de gel pronto para carga) e a interna para a frente (5'-CGC ATG mordaça ACC ACC GTG A-3') e reversa (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') em 0.5 µM.</li>
	<li>Cuidadosamente remova o tapete de silicone da placa de PCR da placa de 96 poços de PCR a primeira rodada e evitar a contaminação cruzada entre os poços.</li>
	<li>Use o replicador de refrigeração para transferir os produtos PCR da placa de 96 poços de PCR do primeiro round para a recém-aliquotadas placa de 96 poços. Realize o PCR aninhado usando as mesmas condições como na etapa 3.8, exceto mudar o passo de desnaturação inicial a 95 ° C a partir de 10 min a 2 min.</li>
</ol>4. PCR produto isolamento e extração do Gel
<ol><li>Analise os produtos PCR por eletroforese em gel usando um 96 poços com gel de agarose 1,3% w/v. Para um gel de agarose de 100 mL, corra a 200 V para 10-15 min.</li>
	<li>Excisar as bandas de DNA dos géis de agarose usando palhas bebendo descartáveis. Para cada produto PCR, coloque a palha e gel de agarose Conecte um tubo de 1,5 mL e apare a palha de tamanho com uma tesoura. Nota: É suficiente para isolar bandas somente a partir dessas diluições em que os produtos de PCR único podem ser resolvidos.</li>
	<li>(Opcional) Armazene os tubos a-20 ° C para posterior extração.</li>
	<li>Ejete os plugues de agarose em cada tubo apertando na extremidade do fragmento de palha. Adicione 300 μL de tampão de extração do gel e 5 μL de dejetos de grânulo de vidro de extração gel a cada tubo.</li>
	<li>Extrair os produtos PCR conforme as instruções do fabricante para o kit de extração do gel (exceto usando metade-volumes para as etapas de lavagem) e eluir o DNA de grânulos com 30 μL de água.</li>
	<li>Submeter o DNA purificado por Sanger sequenciamento (conforme as instruções do fornecedor), com o primer Forward usado na segunda nested PCR.</li>
</ol>5. análise de sequência
<ol><li>Confirme as junções de DNA do vírus-célula, realizando análise de explosão de nucleotídeo (usando configurações padrão alinhando para a coleção inteira de nucleotídeo). Nota: Resultados representativos são detalhados na Figura 3 abaixo.<ol>
<li>Se apenas parcial alinhamento da sequência é observado, apare a 5' sequência de DNA do VHB antes de re-executar uma análise de explosão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplica critérios rigorosos de seleção para determinar se uma determinada sequência representa uma junção de verdadeira integração como segue:<ol>
<li>Incluir apenas as sequências contendo > 20 bp de uma sequência de celular para mapeamento confiante para o genoma celular.</li>
		<li>Desconsidere quaisquer sequências que contêm os sítios de restrição de qualquer enzimas usadas dentro 10 bp da junção integração suposta célula-vírus, como eles provavelmente representam em vitro eventos da ligadura, ao invés de junções de verdadeira integração.</li>
		<li>Desconsidere quaisquer sequências com níveis de fluorescência óbvio pico dissimilares em ambos os lados da junção suposta integração em cromatógrafos de sequenciamento, como estes são prováveis artefatos gerados pela contaminação durante a reação de sequenciamento ou cromatografia capilar.</li>
		<li>Defina eventos de integração único como aqueles com o HBV exata e sequências de celulares na junção de vírus-célula. Nota: A repetição de eventos de integração único pode resultar de expansão clonal de células que contêm essas integrações ou contaminação durante o PCR (que pode ser testado usando reações de controle negativo, ainda mais detalhadas nos resultados representativos abaixo). Integrações repetidas em sequências específicas de celular são esperadas para exibir diferentes sites de terminal VHB para cada evento de integração, como caminhos fim-adesão não-homólogas são utilizados15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a frequência de integração multiplicando-se o factor de diluição de modelos de DNA invertidos pelo número de junções célula-vírus detectado essa diluição, seguido de normalização para a quantidade de entrada de DNA total para a reação de inversão. Geralmente, a frequência de integração é da ordem de 01:104 células.</li>
</ol>

Faculdade é um requerente co e co-inventor do patentes protegendo Myrcludex B como um inibidor de entrada do HBV/HDV. T.T. declara sem conflitos de interesse.

Antes de executar o protocolo, é importante notar que este ensaio de invPCR é uma técnica altamente sensível, capaz de amplificar cópias simples do modelo de DNA. Portanto, limitar a contaminação dos produtos do PCR é de extrema importância. Estratégias gerais para limitar a contaminação do produto PCR incluem o seguinte. (i) estabelece áreas fisicamente separadas para diferentes etapas do método. Cada área deve ter separado de jalecos e luvas devem ser alteradas quando se deslocam entre estas áreas. Listamos estas áreas abaixo em ordem de maior para menos provável de ser contaminados: PCR extração e sequenciamento reação set-up área do produto (pós-PCR); Além do modelo PCR e inflamado-pino transferência área (utilizámos capuzes PCR com uma lâmpada UV descontaminação com bons resultados); Área de extração e inversão DNA (pre-PCR); e uma área de "DNA livre de modelo" usado unicamente para preparar ações e soluções PCR. (ii) estar ciente do fluxo de ar no laboratório como motorista de potencial de contaminação cruzada. Em particular, contaminação de reações de PCR durante a etapa de transferência do pino inflamado é mais provável de ocorrer e vai levar a quantificação imprecisa da frequência de integração. Capas PCR podem ser usadas para limitar essas correntes-Cruz. Poços de controlo negativo (por exemplo, amostras de Myrcludex B-tratados ou sem controles de modelo) no PCR podem ser usados também para testar a contaminação cruzada. (iii) limitar potenciais contaminantes PCR em pipetas e superfícies de trabalho por regularmente, limpando-os para baixo com uma solução de degradação do DNA.
O protocolo especificado aqui é arranjado para detectar a integração de um clone de VHB infeccioso conhecido gerado a partir da célula de HepAD38 linha42. Se o inóculo utilizado é de uma sequência de DNA de HBV diferente (por exemplo, de soro), então o genoma do HBV deve ser primeiro sequenciado para confirmar a compatibilidade do PCR primers e projeto de inversão. Em estudos publicados anteriormente19, nós usamos 3 conjuntos de primers que ligam conservada HBV DNA sequências flanqueando o site esperado dos cruzamentos de integração do DNA do HBV. Outras sequências da primeira demão e protocolos têm sido descritos para determinar a sequência genômica de HBV44,,45,46,,47,48 e podem funcionar com êxito.
Além disso, podem ser usadas diferentes HBV-sensíveis células (por exemplo, hepatócitos humana primária, HepaRG diferenciada, HepG2-NTCP); no entanto, encontramos que as células Huh7-NTCP fornecem a maior relação sinal-ruído, quando se considera o número de vírus-célula junções de DNA que são amplificadas em comparação com o DNA de vírus intermediário que é amplificado13. Em particular, células terminalmente diferenciadas como hepatócitos humanos primários ou HepaRG diferenciado com eficiência não sofrem mitose, resultando em um alto nível de ampliáveis intermediários replicative DNA HBV permanecendo dentro das células. Nós achamos que ~ 90% de sequências amplificadas representam rearranjos de DNA do HBV (e não os eventos de integração) em células terminalmente diferenciadas, em comparação com 70 – 50% no de linhas de células de hepatoma13. Estes produtos são geralmente genomas de HBV DNA contendo grandes exclusões na superfície e núcleo aberto de leitura de quadros, ou eles podem representar quase espécie HBV com um adicional de Ncoeu site prévio para a Spheu site. A amplificação destas espécies de VHB (incluindo um diagrama esquemático) têm sido descritos em detalhe anteriormente13.
Existem várias desvantagens para este método. Devido à natureza laboriosa e multi-dia do presente protocolo, invPCR não é adequado para análises de alta produtividade de um grande número de amostras. Além disso, como se baseia em limitar a titulação de diluição, nosso método não é altamente preciso de quantificação; embora, facilmente deve medir o nível de log de alterações na frequência de integração.
Além disso, nosso protocolo de inversão só é adequado para detectar integrações ocorrem entre região DR2 e DR1 do genoma do HBV, como a maioria das integrações do HBV ocorre dentro desta região49. Análise NGS dos tecidos doentes VHB demonstrou que uma grande minoria (até ~ 50%) também pode ocorrer fora desta região49. Novos desenhos de invPCR são teoricamente capazes de detectar estes outros sites de integração, embora eles não (a nosso conhecimento) foram realizados ainda. Modo, devido as enzima de restrição necessárias sites necessários a jusante da sequência da junção de vírus-célula para a reação de inversão, invPCR não detecta todas as integrações ocorrem nas regiões do genoma do HBV DR2 e DR1 (i.e., nós estimaram que ~ 10% de todas as integrações são detectáveis usando em silico simulações13). No entanto, quando aplicado a um lote de concentrado de amostras com pequeno número de tratamentos diferentes, invPCR é um dos métodos para a detecção de DNA de HBV integrada em uma única par de base resolução apenas práticos.
Portanto, vislumbramos aplicações deste método servindo um papel-chave em encontrar viral (através de mutações do inóculo HBV), celular (através de nocaute ou superexpressão de genes celulares específicos, ou através da aplicação de várias drogas) e ambiental ( por exemplo, exposição ao stress oxidativo) fatores que induzem a integração do DNA do HBV. Com este método e recentemente desenvolvidos sistemas de infecção pelo VHB, possibilitamos controle sem precedentes desses fatores para que eles podem ser melhor caracterizadas e bem isolados. Esperamos também que isto levará a uma compreensão fundamental das consequências da integração do HBV DNA, incluindo a que antígenos virais de medida (por exemplo, HBx ou HBsAg50) são expressos de forma integrada, o que controla essa expressão, celulares e ou não a integração do HBV muda significativamente o fenótipo celular em direção um estado mais pro-oncogênica. Os resultados destes estudos futuros terá um profundo impacto sobre as estratégias terapêuticas utilizadas no tratamento da hepatite crônica B e na compreensão básica do vírus em si.

HBV é um vírus DNA de dupla-hélice que podem causar infecção crônica ao longo da vida, levando à cirrose hepática e hepatocelular carcinoma (HCC)1,2,3. Embora existam vários mecanismos moleculares de condução HBV persistência4 (por exemplo, alta estabilidade do modelo transcriptional epigenética viral), evasão da vigilância imunológica e baixa rotatividade de hepatócitos no fígado e seus associados risco de HCC iniciação5,6 (por exemplo, inflamação crônica e ativação de celulares estresse caminhos), integração de HBV DNA no genoma da célula de acolhimento (um mecanismo relatado para ambos estes fenômenos) foi estudada mal . Das principais razões é a falta de adequado em vitro infecção sistemas para HBV que permitem a detecção confiável de eventos de integração. Aqui, descrevemos um protocolo recentemente desenvolvidos para tanto in vitro geração e detecção de integrações de HBV DNA que podem ser usados para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes e suas consequências.
Replicação do HBV e a formação de integração do DNA do HBV tem sido avaliado anteriormente no detalhe7. Brevemente, o HBV entra em hepatócitos usando o peptídeo de Co-transporting de Taurocholate de sódio (NTCP) como o principal receptor celular para infecção8,9. Os envoltos HBV contendo o DNA circular HBV-relaxado (rcDNA) genoma entra no núcleo, onde o rcDNA é convertido em DNA circular fechado covalentemente epissomal (cccDNA). O cccDNA nuclear atua como o modelo transcriptional para mRNAs virais e pre-genoma RNA (pgRNA)10. PgRNA e polimerase do VHB são então empacotados em envoltos recém formado (compostos por dímeros de proteína núcleo HBV). PgRNA HBV é reverso-transcrito dentro o nucleocapsídeo, resultando em um genoma de rcDNA ou uma dupla-hélice linear (dslDNA) de DNA do genoma11,12. Estes envoltos maduros que contém genomas DNA HBV são finalmente envelopados e exportados como virions.
Infecção dos hepatócitos por partículas envelopadas contendo moléculas de dslDNA pode resultar em integração viral para o anfitrião célula genoma13, levando a formas de replicação-incompetente de HBV DNA7,14,15. Integração do DNA do HBV ocorre no local da cromossômica double-stranded DNA quebras15. Acumular evidências sugere que cada evento de integração ocorre em uma posição essencialmente aleatória no genoma de célula o anfitrião16,17. Além disso, a integração do DNA do HBV ocorre um tanto raramente, a uma taxa de 1 por 104 células13,18,19,20. Importantes questões relacionadas com a integração do DNA do HBV permanecem sem resposta, particularmente sobre a exatas moleculares vias envolvidas, a dependência de viral e fatores do hospedeiro, os antígenos virais expressados de formas integradas e sua possível contribuição a persistência viral7. Criaram um modelo in vitro para lançar luz sobre algumas destas perguntas.
A raridade de eventos de integração HBV DNA (ambos com relação a taxa de integração por célula e o número de cópia de cada original integração) na infecção por HBV em vitro modelos fazem-lhes um desafio para detectar. Mitose celular é limitada no nosso sistema in vitro , como células divisórias não oferecem suporte a infecção eficiente. Assim, ao contrário de em pacientes fígados tecidos onde significativa expansão clonal dos hepatócitos ocorre18,19,,20, muito que poucas cópias (1 a 2) de cada integração estão presentes em um determinado pool de células infectadas em vitro . Também achamos que a integração ocorre principalmente durante a infecção inicial dos hepatócitos (e não continuamente nos hepatócitos cronicamente infectadas)13. Nesse sentido, integração de HBV DNA não pode ser aumentada por simplesmente cultivo as células para um período mais longo.
Em geral, os métodos anteriormente utilizados para detectar DNA de HBV integrado, incluindo o sul da borre hibridização21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , mediada por gaveta ligadura PCR28e genoma sequenciamento29,30,31,32,33, não têm a sensibilidade para detectar Single-cópias das integrações. Nós e outros pesquisadores têm usado inverso nested PCR (invPCR) para detectar hepadnaviral integração de DNA em pato, marmota e humano infectado fígados13,14,18,19, 34,35,36. Outros introduziram modificações processuais para a técnica de invPCR que podem alterar a geração de sinais de falso-positivos e restringir a capacidade para quantificação de37. Se o ensaio for realizado conforme descrito no presente protocolo, invPCR representa um ensaio específico e sensível que identifica e quantifica (em números absolutos cópia) múltiplas integrações de HBV DNA. A junção do DNA HBV-célula é sequenciada em uma resolução de par de base única, permitindo estudos de bioinformatical de viral e sequências de DNA do anfitrião aos sítios de integração13.
Descrevemos anteriormente38 resultados de invPCR no DNA do HBV-infectados tecido extraído de uma grande variedade de fontes, incluindo tecidos fígados congelado snap, seções de fígado parafina e amostras de tecido extremamente pequeno isoladas por laser-microdissection19. Este protocolo descreve uma versão atualizada de um ensaio de invPCR usando o DNA extraído de tecidos de cultura-derivado de célula depois em vitro infecção, no qual são gerados números de cópia baixa de integrações (1 – 2 cópias por integração). O DNA do HBV integrações formadas em vitro se assemelham aos encontrados nos tecidos doentes no que diz respeito a sua distribuição sobre o genoma celular e junção dentro da sequência viral que é integrado13,16, sugerindo um via comparável para dentro um fígado infectado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

Vírus da hepatite B (VHB) é um patógeno comum pelo sangue causando câncer de fígado e cirrose hepática, resultantes de infecção crônica. O vírus Replica geralmente através de um DNA epissomal intermediário; no entanto, integração de fragmentos de DNA do HBV no genoma do hospedeiro tem sido observada, embora esta forma não é necessária para a replicação viral. A finalidade exata, sincronismo e mecanismo (s) pelo qual DNA HBV ocorre integração é ainda não é claros, mas recentes dados mostram que ocorre muito cedo após a infecção. Aqui, a in vitro geração e detecção de integrações de HBV DNA são descritas em detalhes. Nosso protocolo especificamente amplifica única cópias de integrações de DNA do vírus-célula e permite tanto a quantificação absoluta e a resolução de base única par da sequência de junção. Esta técnica foi aplicada a vários tipos de células HBV-sensíveis (incluindo hepatócitos humanos primários), para vários mutantes do HBV e em conjunto com várias exposições de drogas. Prevemos que esta técnica tornando-se um ensaio fundamental para determinar os mecanismos moleculares subjacentes deste fenômeno clinicamente relevantes.

Uma representação esquemática da técnica invPCR é mostrada na Figura 1. Uma electroforese do gel do agarose exemplo de um invPCR bem sucedido é mostrado na Figura 2 , antes e após o isolamento do produto PCR. A Figura 3 mostra a saída de análise de explosão da etapa 5.1 nos casos de (i) amplificação da junção de DNA do vírus-célula e (ii) a amplificação de um intermediário replicative DNA de HBV.
Resultados de controlos positivos esperados: células de Huh7-NTCP infectadas com heparina-purificado estoques HBV como descrito acima (Figura 1) podem servir como um controle positivo. Nesta instância, o único produtos PCR devem ser conseguidos a diluição de 1:3 segundo ou terceiro de cada amostra (correspondente ao equivalente de célula de4 ~ 10 por diluição, Figura 2). Nestas diluições, aproximadamente 50% dos produtos representará entroncamentos de DNA de vírus-célula verdadeira, enquanto a outra metade representa a amplificação de intermediários de HBV DNA (Figura 3).
Em anteriores estudos13, encontramos alguns exemplos de cruzamentos repetidos vírus-célula, não sugerindo nenhum celulares sites genômicas de integração preferencial do HBV DNA. Encontramos, também, que >80% dos cruzamentos de vírus-célula ocorrem entre nucleotídeos 1732 e 1832 (de acordo com o nucleotídeo numeração de genótipo HBV D, GenBank adesão #U95551.1), onde este último representa o terminal da direita do formulário dslDNA HBV. Sequências de junções de verdade vírus-célula encontradas através de nosso método em experimentos em vitro são publicamente disponíveis no GenBank (números de adesão MH057851, de MH058006).
Resultados de controlos negativos esperados: não infectados células Huh7-NTCP ou inoculados Huh7-NTCP células pré-tratadas com Myrcludex B podem atuar como controles negativos. InvPCR análise de DNA extraído destas células deve produzir sem produtos PCR. Estas amostras controle negativo em execução no mesmo prato PCR como amostras positivas permite teste de contaminação durante o processo de nested-PCR. O teste mais rigoroso para contaminação cruzada é a execução de uma amostra de controle negativo em poços A-D e a amostra positiva em poços E-H sobre uma placa de 96 poços. Neste caso, a mais concentrada diluição da amostra positiva é executada em uma linha diretamente adjacente para a menos concentrada diluição da amostra negativa. Se produtos de amplificação são observados em amostras de controlo negativo, instituir as medidas propostas na discussão para minimizar a contaminação eventos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Figura 1: figura esquemática do processo de invPCR para detectar integrações de HBV DNA. Após a infecção pelo VHB, apenas uma minoria das células Huh7-NTCP contêm HBV dslDNA (vermelho) integrado no genoma da célula de acolhimento (vermelho), descrita na seção superior. DNA total é então extraído das células (etapa 1) invertido (passo 2) e amplificado por PCR aninhado (etapa 3). São mostradas as posições relativas dos sites de enzima de restrição (NcoI e BsiHKAI) na junção de DNA de vírus-célula extirpado. A figura é uma adaptação de uma anterior publicação13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Figura 2: gel de Agarose eletroforese e gel de posterior extração de um bem sucedido invPCR. "M" representa a escada de marcador de DNA. Cada linha de 12 representa técnicas repetições em uma única diluição na placa do PCR. Duas amostras de DNA invertidas podem ser executadas por gel de agarose/placa do PCR. Os produtos PCR para cada diluição devem dosear fora em um ~ 1: relação de 3. Extração de produtos de duas diluições menos concentradas onde bandas única podem ser facilmente isoladas é geralmente suficiente, como taxa de integração do DNA do HBV é determinada por titulação de ponto de extremidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Figura 3: análise de explosão de sequências de produto invPCR. Como longas extensões de sequência são gerados a partir de Sanger sequenciamento, a fonte de sequências de DNA é geralmente sem ambiguidades. Forte alinhamento para HBV e genomas celulares é observado em diferentes áreas do arquivo FASTA sequência gerada a partir de Sanger sequenciamento no painel superior, sugerindo uma junção de DNA do vírus-célula verdadeira. No painel inferior, a sequência alinha-se apenas de fragmentos do genoma do HBV, sugerindo um produto gerado pela amplificação de um genoma de DNA de HBV rearranjada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Descrevemos aqui a in vitro geração de HBV DNA através de um sistema de infecção de vírus de hepatite B e a detecção altamente sensível de sua integração (1 – 2 cópias) usando o inverso nested PCR.

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Esse método pode ser usado para responder a perguntas-chave na virologia da Hepatite B, como encontrar fatores celulares ou virológicos que afetam a integração do DNA do HPV. Há múltiplas vantagens nessa técnica. É relativamente barato, e fácil de realizar, a análise dos resultados é simples, e é muito sensível, até cópias simples.Embora este método possa ser usado para fornecer informações sobre a integração do HBV, ele também pode ser usado para outros vírus que se integram ao genoma da célula hospedeira, como HIV, HTLV-1 ou HPV. Para infectar as células, sementes 200.000 células por mililitro em uma placa de doze poços, com 1 mililitro de D-mem. No dia seguinte, use a coluna Heparin purificada su-per-na-din do HEP-AD 38 como inoculante para infectar as células a 1.000 VGE por célula, em 500 microliters de meio de cultura.Então, cultue as células a 37 graus Celsius. Então, no dia seguinte, lave as células duas vezes com um mililitro de estéril uma vez PBS. Em seguida, substitua o meio de cultura a cada 2 dias, até a colheita.No dia 3 pós infecção, trate as células com 5 micromolar tenofovir desoproxil e 10 micromolars lamivudina para limitar a produção de intermediários replicativos HBV que são amplificados por PCR inverso. No dia 5, pós-infecção, triplize algumas células com 200 microliters de Trypsin EDTA e suspenda-as em 2 mililitros de D-mem contendo 5 micromolar Tenofovir disoproxil e 10 micromolar Lamivudine. Posteriormente, transfira as suspensões celulares para uma placa de seis poços, para induzir uma rodada de mitose.No 7º dia pós infecção, trippsinize as células expandidas em 400 microliters de Trypsin EDTA e suspenda a mistura em 1 mililitro de D-mem. Em seguida, transfira a suspensão em um tubo de 1,5 mililitro. Pelota as células por centrifugação a 500 vezes G, por cinco minutos.E remova o Su-per-na-din por aspiração. Extrair o DNA da cápsula celular usando um kit de extração de DNA, de acordo com a instrução do fabricante. Para inversão de DNA, aloque 1,5 a 2,5 microgramas do extrato total de DNA em um tubo PCR de 200 microliter.Em seguida, adicione a quantidade apropriada de restrição do mix mestre da enzima para resultar em um microliter de volume de reação, contendo 1 vezes tampão de reação de digestão e 10 unidades NCO-1HF. Incubar a reação enzimática de restrição em uma máquina PCR a 37 graus Celsius por uma hora, para uma ótima eficiência de digestão. Em seguida, inativar a enzima de restrição incubando-a 80 graus Celsius por 20 minutos.Transfira toda a reação da enzima de restrição para um tubo de 1,5 mililitro. Posteriormente, adicione 400 microlitadores de 1 vezes tampão de ligase de DNA T4 e 500 unidades de ligadura de DNA T4, e misture bem. Um grande volume de reação incentiva a ligadura intramolecular dos fragmentos de DNA digeridos.Incubar a reação de ligadura à temperatura ambiente por 2 horas para garantir a ligadura completa. Após 2 horas, inative a liga ligase de DNA T4 a 70 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitres de 10 Sulfato dodedecyl de sódio para garantir a inativação completa da ligadura T4.Adicione cloreto de sódio a uma concentração final de 100 milimil, e Dextran a uma concentração final de 90 microgramas por mililitro. Misture por vórtice de pulso e gire brevemente a mistura de reação. Em seguida, adicione 900 microliters de 100 etanol, e misture por inversão.Precipitar o DNA a 20 graus Celsius negativo durante a noite. E pelota o DNA precipitado por centrifugação a 14000 vezes G por 15 minutos. Depois, remova o Su-per-na-dine por aspiração.Lave a pelota com 500 microliters de 70 etanol. E centrifugação a 14.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, remova o Etanol por aspiração e seque a pelota de DNA à temperatura ambiente por 20 minutos.Dissolva a pelota em 20 microliters de água e adicione 20 microliters de mistura mestre enzimada restrita para resultar em um volume de reação de 40 microliteres, contendo 1 vezes tampão de reação de digestão, 5 unidades BSIHK-1 e 5 unidades de SPH-1HF. Nest, incubar a reação enzimática de restrição em um bloco de calor a 37 graus Celsius, por 1 hora. Gire brevemente a mistura de reação, incubar a reação enzimática de restrição em um bloco de calor a 65 graus Celsius por 1 hora.Neste procedimento, remova amplicons potenciais de uma vedação de tapete de silício reutilizável, usando uma solução de degradação de DNA. Enxágüe bem o tapete com água livre de DNA e o ar seque-o à temperatura ambiente. Em seguida, prepare um mililitro de 1 vezes mistura PCR contendo os primers externos para a frente e para trás a uma concentração de 0,5 micromolar.Adicione 170 microliters se a mistura de 1 vezes PCR aos poços A-1 e E-1, em uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, adicione 120 microliters da mistura de 1 vezes PCR aos poços B-1 e H-1. Depois, adicione 10 microliters do DNA invertido aos poços A-1 e E-1.Misture a reação em cada poço, em pipetando suavemente cada um, cerca de 10 vezes usando um conjunto P-1000 para 100 microliters. Diluir as amostras de poços A-1 para D-1, numa proporção de 1:3, transferindo 60 microlitadores a cada etapa. Misture os poços a cada passo, em pipetando-os suavemente cerca de 10 vezes usando um conjunto P-1000 para 100 microliters.Evite formar bolhas, repita o procedimento para bem E-1, diluindo até bem H-1. Posteriormente, aloque 10 microlitadores da mistura de reação, usando pipeta multicanal, de Wells A-1, H-1, em poços A-2, H2, A-3, H-3 e assim por diante, até atingir os poços A-12, H-12 da placa de poço 96. Cubra a placa PCR com um tapete de silicone seco e pressione firmemente.Em seguida, coloque a placa em uma máquina PCR e execute o programa indicado, antes de transferir a placa para a temperatura ambiente. Depois, aqueça os pinos de um replicador de 96 pinos para o vermelho-quente com um queimador Bunsen, em seguida, esfrie por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. Encha os poços de uma segunda placa PCR com 10 microliters de 1 vezes mistura PCR, contendo um buffer pronto para carga de gel, e o interior para frente e contra-invertido em 0,5 micromolar.Remova cuidadosamente o tapete de silício da placa PCR da placa 96 da primeira rodada do PCR, e evite a contaminação cruzada entre os poços. Use o replicador refrigerado para transferir os produtos PCR da placa 96, desde pcr de primeira rodada até a recém-alocada placa de 96 poços. Realizar o PCR aninhado, utilizando a condição conforme indicado.Para isolar os produtos PCR, analise-os por eletroforese de gel, utilizando uma placa de 96 poços, com gel 1.3 Agarose. Para um gel Agarose de 100 mililitros, corra a 200 volts por 10 a 15 minutos. Depois, extirem as bandas de DNA dos géis de Agarose, usando canudos descartáveis.Para cada produto PCR, coloque a palha e o gel Agarose plug em um tubo de 1,5 mililitro, corte a palha ao tamanho com uma tesoura. Depois, ejete os plugues Agarose em cada tubo, apertando na extremidade do fragmento de palha. Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de extração de gel, e 5 microliters de contas de vidro de extração de gel em cada tubo.Extrair os produtos PCR por instruções do fabricante para o kit de extração de gel, e diluir o DNA das contas com 30 microliters de água. Envie o DNA purificado para sequenciamento Sanger, com o primer dianteiro usado na segunda rodada aninhada PCR. Um exemplo de eletroforese de gel agarose de pcr inverso bem sucedido, antes e depois do isolamento do produto PCR, é mostrado aqui.M representa o marcador de DNA último, cada linha de 12 representa as réplicas técnicas em uma única diluição na placa PCR. Neste caso, os produtos pcr únicos devem ser alcançados até a segunda ou terceira diluição de 1:3 de cada amostra. Nessas diluições, aproximadamente 50% dos produtos representarão verdadeiras junções de DNA de células do vírus.Enquanto a outra metade representa amplificação dos intermediários de DNA HBV. Essa técnica permitiu aos pesquisadores explorar a integração do DNA do HPV em sistemas de infecção in vitro altamente controlados. Métodos adicionais, como análise biotemática, podem ser usados para responder a mais perguntas.Por exemplo, se a integração do DNA do HPV ocorrer em regiões específicas do genoma celular. Não se esqueça que trabalhar com infecção O vírus da hepatite B pode ser perigoso e controles adequados de infecção, como armários de bio segurança e vacinação prévia, devem ser sempre tomados durante a realização desses procedimentos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Imunologia e Infecção

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...