Apresentamos o primeiro modelo de cultura celular para infecção por Poliomavírus Celular de Merkel. O protocolo inclui isolamento dos fibroblastos dérmicos, preparação da infecção pelo vírus MCPyV, coloração imunofluorescente e hibridização fluorescente in situ. Este protocolo permite estudar o ciclo infeccioso mcpyv e interações com células hospedeiras, evitando artefatos associados à superexpressão de genes virais.
Para começar, use uma tesoura para cortar a gordura e o tecido subcutâneo do prepúcio neonatal humano. Corte a amostra de pele em metades ou trimestres. Coloque o tecido em 5 mililitros de 10 miligramas por mililitro de base II NPBS, suplementado com antibiótico-antimíctico.
Incubar a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use fórceps de microdisseção para separar cuidadosamente a epiderme das camadas dérmicas em um prato de 10 centímetros. Transfira o tecido dérmico resultante para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 5 mililitros de 2 miligramas por colagenase mililitro tipo IV em meio livre de FBS complementado com antibiótico-anitmycotic.
Incubar a amostra a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% com agitação periódica por quatro a seis horas, até que apenas alguns agregados de tecido macroscópico permaneçam. Depois disso, use uma pipeta de 10 mililitros para pipeta a solução amostral para cima e para baixo vigorosamente 10 vezes, liberando células únicas da derme. Centrifugar a 180 g por cinco minutos e descartar o supernatante.
Emplaque as células dissociadas em meio DMEM suplementado. No final da tarde ou à noite, semente 6 milhões de células 293TT28 em um prato de 10 centímetros contendo meio DMEM suplementado. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, certifique-se de que as células são cerca de 50% confluentes, depois transfeito as células com 66 microliters de reagente transfeccionado, 12 microgramas de MCPyV re-ligado isolar DNA R17B, 8,4 microgramas de expressão ST plasmid pMtB, e 9,6 microgramas de expressão LT plasmid pADL. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, quando as células transfeinadas são quase confluentes, experimento as células e as transferem para um prato de 15 centímetros para expansão contínua.
Quando esse prato se tornar quase confluente, transfira as células em três novos pratos de 15 centímetros. Quando esses novos pratos se tornarem quase confluentes, colde as células como descrito no protocolo de texto. Centrífuga a 180 g em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, remova o supernasce e adicione um volume celular de magnésio DPBS. Adicione 25 sulfato de amônio micromolar, seguido por 0,5% Triton X-100, 0,1% benzonase e 0,1% de um DNAse dependente de ATP. Misture bem e incubar a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, esfrie a mistura no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 0,17 volume de cloreto de sódio. Misture e incubar no gelo por mais 15 minutos.
Centrifugar a 12 mil g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o supernatante não estiver claro, inverta suavemente o tubo e repita a centrifugação. Depois disso, transfira o supernatante para um novo tubo.
Resuspend a pelota em 1 volume de DPBS suplementado com 0,8 mols de cloreto de sódio. Centrifugar a 12 mil g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o supernatante não estiver claro, inverta suavemente o tubo e repita a centrifugação.
Combine as duas supernacantas e centrífuga novamente a 12 mil g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta para depositar gradientes de iodixanol em tubos de polímero de paredes finas, conforme descrito no protocolo de texto. Carregue 3 mililitros do supernanato contendo vírus esclarecido em cima do gradiente iodixanol preparado.
Centrifugar com rotor SW 55 Ti a 234 mil g e a 16 graus Celsius por 3,5 horas, certificando-se de definir a aceleração e desaceleração para desacelerar. Após a ultracentrifugação ser concluída, colete 12 frações em tubos siliconizados. Depois de manter e desprender as células, a 10 mililitros de DMEM suplementado e meio F12 para o prato.
Transfira a solução celular para um tubo de 15 mililitros. Centrífuga a 180 g por dois minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em DMEM e F12 médio suplementados a uma densidade celular entre 20 mil e 40 mil células por mililitro.
Em seguida, sementes 200 ou 400 microliters da suspensão celular suplementadas com 1 miligrama por mililitro de colagenase tipo IV em cada poço de uma placa de 24 ou 96 poços, respectivamente. Remova o estoque de viron MCPyV do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque no gelo para descongelar. Adicione 1 bilhão de equivalentes de genoma viral de virions MCPyV por um microliter de iodixanol para cada 2500 a 5000 células a serem infectadas.
Bata suavemente na lateral da placa e incuba a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Primeiro, fixe as células em deslizamentos de cobertura com 4% pfa em PBS por 10 minutos, depois lave os deslizamentos de tampa duas vezes com PBS e trate-as com 70% de etanol a quatro graus Celsius durante a noite para permeabiliizar as células. No dia seguinte, substitua o etanol por tampão de hidratação da sonda e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos para pré-hibridizar as amostras.
30 minutos antes do fim da incubação de pré-hibridização, diluir as sondas na solução de hibridização da sonda a uma diluição de 1:500 e incubar a 45 graus Celsius. Quando as incubações estiverem completas, pipeta aproximadamente 10 microlitros da mistura da sonda diluída em um slide de microscópio para cada deslizamento de cobertura. Coloque cada lado da célula de deslizamento de cobertura para baixo em sua respectiva gota de mistura de hibridização.
Usando uma quantidade liberal de cimento de borracha, sele as bordas e a parte de trás de cada deslizamento de cobertura ao seu slide. Coloque o slide no lado plano de um bloco de calor e aqueça-os a 94 graus Celsius por três minutos. Depois disso, transfira o slide para uma câmara umidificada e incuba-os a 45 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, use fórceps para descascar cuidadosamente o cimento de borracha. Coloque a tampa deslizando lado da célula para cima nos poços de uma placa de 24 poços e lave-as com tampão de lavagem da sonda três vezes à temperatura ambiente. Adicione 200 microliters de tampão de amplificação a cada poço contendo um deslizamento de cobertura e incubar à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos.
Enquanto isso, anneal cada um dos dois grampos de oligonucleotídeo rotulados reconhecendo as sondas em tubos PCR separados aquecendo-os a 94 graus Celsius por 90 segundos, e depois resfriando-os à temperatura ambiente por 30 minutos. Misture os grampos em tampão de amplificação a uma diluição de 1:50. Em seguida, estique o filme de parafina sobre a face aberta de uma tampa de placa de 12 poços para fazer uma superfície para a reação de amplificação.
Pipeta 50-100 gotículas de microliter da mistura de grampos no filme de parafina para cada deslizamento de cobertura. Usando fórceps, remova cuidadosamente cada deslizamento de cobertura da solução de pré-amplificação e toque na borda de um lenço descartável poroso para secar. Coloque cada lado da célula de deslizamento de cobertura seca para baixo em uma gota de amplificação.
Transfira a tampa da placa para uma câmara umidificada e incubar durante a noite à temperatura ambiente e no escuro. No dia seguinte, devolva os deslizamentos de cobertura para os poços da placa de 24 poços. Adicione 5X SSCT contendo DAPI a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora.
Depois disso, lave as amostras duas vezes com 5X SSCT em temperatura ambiente. Monte a tampa lavada desliza em slides de microscópio e use um microscópio de fluorescência invertida para analisar as células e a imagem das amostras. Neste estudo, uma população quase homogênea de fibroblastos dérmicos humanos é isolada.
A coloração imunofluorescente revela que quase 100% das células dérmicas humanas isoladas estão positivamente detidas para marcadores de fibroblasto dermal, vimentina e colágeno, mas negativo para o marcador de queratinócito de foreskin humano K14. Os virions MCPyV são então gerados e depois de visualizar a banda de virions MCPyV concentradas no núcleo do gradiente, 500 frações de microliter são coletadas e mcPyV qPCR é realizado para identificar as frações de pico. Imagens imunofluorescentes de HDFs infectados com MCPyV são mostradas aqui, onde células que são LT positivas, VP1 positivas ou lt e VP1 positivo são consideradas positivas para a infecção pelo MCPyV.
Mais de 30% das células são LT positivas, e mais de 10% são VP1 positivas. Os genomas MCPyV replicados nas células infectadas são detectados usando tanto o PEIXE HCR-DNA quanto o PEIXE DE DNA Imunofluorescente-HCR-DNA. Enquanto o HCR-DNA FISH revela a localização do DNA MCPyV presente na fábrica de replicação, os métodos de peixes imunofluorescentes-HCR-DNA permitem a detecção simultânea do DNA MCPyV e da co-localização da proteína LT nos centros de replicação.
Para alcançar a melhor eficiência de infecção por vírus, é muito importante que o MCPyV esteja concentrado em pelo menos 2 x 10 a 8º genoma do vírus por microliter, já que o iodoxanol é tóxico para as células. Após a infecção por MCPyV dos fibroblastos dérmicos, muitas análises biológicas moleculares podem ser realizadas, incluindo imunofluorescência, imuno-bloqueio, imunopositigação e ensaio baseado em qPCR. O sistema de infecção que descrevemos torna possível que os pesquisadores estudem estágios da infecção pelo MCPyV, como tráfico nuclear e embalagens virais.
MCPyV é um vírus BSL-2, mas pouco se sabe sobre seu potencial de patologia nas quantidades alcançadas em um ambiente laboratorial. Portanto, os pesquisadores devem tomar precauções para evitar a exposição ao vírus.
