このプロトコルは、腫瘍細胞と神経との初期の相互作用のインビボ研究と、癌における神経浸潤の分子経路の研究を可能にする。この技術の主な利点は、同じ実験で周回神経浸潤および他の癌の型を研究する可能性を持つ短い実験時間である。この技術を初めて試す前に、商業用非受精卵を掘削し、両方の手順のためのあなたの技術を最適化するために、底根神経節を収穫する練習をお勧めします。
この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるミン・リュウです。1日目の受精後の日に摂氏38度、湿度54%で、毎時回転して8日間、実験群あたり6個の市販病原体を含まない受精卵を1回分の1に培養します。8日目には、70%エタノールで安楽死ラットの背部皮膚をきれいにし、はさみを使用して背骨を取り除きます。
子宮頸部、胸部、および腰部を分離し、組織サンプルを水分補給するためにPBSで10センチメートル培養皿に脊椎セクションを置きます。繊細な骨はさみを使用して、背部および腹側の側面の胸部および頸椎骨を開き、背骨を2つの側面半分に分離し、組織切片を新鮮なPBSできれいな10センチメートル皿に入れる。鉗子を使用して、脊髄を脊椎骨から静かに取り外し、後根神経節を視覚化する。
各神経節の下に保持されている細かい鉗子のペアの先端を配置し、組織をつかみ、それが収容されている骨腔からそれを引っ張ります。収穫直後に、2%ペニシリンとストレプトマイシンまたはペンストレップを添加したDMEM培地に各神経節を入れ、10%の胎児ウシ血清またはFBSを使用して、神経組織の細菌汚染を防ぎます。すべての神経節が収穫されたら、2%Pen-Strepプラス10%FBSと1ミリリットル当たり1.2マイクログラムの赤蛍光色素を添加した新鮮なDMEM培養培地を含む新しい培養皿に組織を移し、細胞培養インキュベーターで1時間のインキュベーションを行います。
後根神経節移植のために卵を準備するには、層流キャビネットの光を暗くし、自然発生する空気嚢を光源に向かって卵を保持し、各卵をトランスライトしてひよこの生存率と胚性相をチェックする。発達中の胚が卵膜に付着した暗い移動容器として絨毛体膜に付着していることを特定し、鉛筆を使用してこの領域への介入を避けるために添付ファイルをマークする。胚付着から少なくとも2センチメートルの血管化領域に1.5センチメートルの領域を描き、手術窓領域として作用し、手術窓から約1センチメートルの血管化領域に0.5センチメートルの正方形を描きます。
次に、空気嚢領域の中心をマークします。次に、ロータリーツールと彫刻ドリルを使用して直径3ミリメートルのビットを使用して、マークされた正方形内の卵殻を慎重に掘削します。殻のすぐ下の白い外卵殻膜を取り除かずに卵殻を取り除くために鈍い鉗子を使用してください。
ドリルを使用して、空気嚢領域のマークされた十字架にピンポイントドリル穿孔を慎重に行い、シェルを壊したり損傷を与えたりすることなく卵に空気を流し込み、無傷の卵殻膜の上の正方形の開口部に30マイクロリットルのHBSSを追加します。30ゲージ針を使用して、正方形の領域内の外膜にピンポイントの穿径を作ります。次に、卵を光源まで持ち上げて空気嚢を視覚化し、スポイトゴム球に圧力をかける。
スポイト球根を空気嚢内の小さな穿径に置き、手術窓領域内の外膜と絨毛管内膜の分離が観察されるまで、電球の圧力を放出し、膜の完全な分離が達成されるまでこのステップを繰り返す。すべての卵が同じ方法で変更された場合は、外側の卵殻膜を破裂させないように注意して1つの卵で円形の操作ウィンドウを掘削し、接着剤テープの粘着性の側面を使用してシェルから緩い粒子を取り除きます。鈍い鉗子を使用して、掘削された領域から卵殻を取り除き、続いて外側の卵殻膜を取り除き、汚染を最小限に抑えるために卵の中に小さな殻粒子を導入しないように注意してください。
卵殻と外膜が実証されているように取り除かれたら、パラフィンワックス膜で卵を覆い、背根神経節が移植の準備ができるまで卵を回転させることなく卵インキュベーターに戻します。絨毛神経細胞膜に底根神経節を移植する場合は、細かい無菌鉗子を使用して培養皿の1つの神経節を慎重に把握し、新鮮なHBSSの容器で組織を穏やかに洗浄します。1つの卵の絨毛膜に神経節を置き、膜を穿刺しないように注意し、無菌透明フィルムドレッシングで卵の開口部のすべてを覆います。
すべての卵が移植されたら、回転せずに2日間加湿卵インキュベーターに戻します。インキュベーションの最後に、卵を層流キャビネットに移し、はさみと鉗子を使用して透明なフィルムドレッシングを開きます。次に、5マイクロリットルのHBSSの蛍光標識腫瘍細胞を、各背根神経節から約2ミリメートル離れた各卵の絨毛管内膜に0.5〜100万個の蛍光標識腫瘍細胞を加え、神経節と細胞の間の均一な距離を保つ。
その後、新しいフィルムドレッシングで卵を覆い、卵を回転なしで7日間卵インキュベーターに戻します。インキュベーションの終わりに、卵を実験室のベンチの上に置きます。注射器を使用して各卵の膜ドレッシングを穿穿透過し、各絨毛管内膜に約300マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを塗布し、組織をわずかに硬くして収穫プロセスを容易にする。
はさみを使用して、絨毛管内膜を取り付けた卵殻の上半分を取り除きます。シェル断片の中央に、底根神経節と腫瘍細胞を移植した絨毛管内膜の部分を維持し、シェルのサイズを約3センチメートルの直径に縮小します。次に、細かい鉗子で絨毛神経細胞膜をつかみ、卵殻から組織を取り外して、4%パラホルムアルデヒドの2ミリリットルを含む6ウェルプレートの1つの井戸に移管します。
絨毛管内膜は実験中に後根神経節組織に栄養を与えるため、絨毛根神経節の絨毛膜への統合は重要である。顕微鏡的には、絨毛管内の結合組織内に視認される後根神経節と、血管がしばしば、絨毛膜血液供給が移植組織を育てていることを示唆する、肛門根神経節組織の内部に見られる。移植された腫瘍は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって絨毛管内膜上でも同定される。
どのくらいの浸潤が存在するかに応じて、腫瘍は結合組織に侵入する多数の腫瘍島に存在しない可能性があります。本代表的な実験では、結合蛍光分析による画像化により、コントロール腫瘍と比較してガラニン受容体2を発現する上で腫瘍細胞を移植した絨毛球膜における側根神経節の浸潤が増加することが明らかになった。この有用で費用対効果の高い生体内モデルの周神経侵入は、限られた資源を有する実験室によっても複製することができる。
