सीटू में तीव्र पूर्व वीवो भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों में अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन

अक्षतंतु जटिल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मैट्रिक्स को कैसे नेविगेट करते हैं, यह न्यूरोबायोलॉजी में एक मौलिक प्रश्न है। यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ शारीरिक वातावरण में अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण मस्तिष्क में डीएनए के वितरण के लिए पाइपलाइन को समाप्त करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल अंत का वर्णन करता है, उच्च गुणवत्ता वाले ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस की तैयारी और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका।

हालांकि मूल रूप से भ्रूण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अक्षतंतु गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस प्रोटोकॉल को दर्दनाक या रोग संबंधी स्थितियों के बाद ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति और अक्षतंतु प्लास्टिसिटी के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देने के लिए समायोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल अपने आप में अपेक्षाकृत सरल है। हालांकि, मस्तिष्क संरचनाओं के अपने पहले लेबलिंग और संरक्षण को प्राप्त करना महत्वपूर्ण बिंदु हैं।

इसलिए, इलेक्ट्रोपोरेशन, मस्तिष्क विच्छेदन, और स्लाइसिंग चरणों को अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन करना सहायक होगा, और डॉक्टरेट छात्र ब्रैकेट की प्रयोगशाला से है। एक गर्भवती मादा माउस को बेहोश करने के बाद, गर्म खारा या संदंश में भिगोए गए कपास की कली का उपयोग करके दोनों गर्भाशय सींगों को बाहर निकालने के लिए एक चीरा बनाएं, ध्यान से भ्रूण के बीच रिक्त स्थान को हथियाएं।

फिर भ्रूण को गीले धुंध पर रखें। गर्भाशय थैली को काटने के बाद, प्रत्येक भ्रूण को हटा दें। बर्फ पर ग्लूकोज के साथ पूरक एचबीएसएस युक्त 10 सेंटीमीटर डिश में भ्रूण रखें।

पूर्व गर्भाशय विद्युतीकरण के लिए, एक भ्रूण उठाएं और इसे धारक में रखें। फिर ध्यान से पार्श्व वेंट्रिकल में भ्रूण खोपड़ी के माध्यम से डीएनए तेजी से हरे रंग के मिश्रण वाले ग्लास केशिका को डालें, और प्रत्येक वेंट्रिकल में डीएनए प्लास्मिड मिश्रण के दो से तीन माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। इसके बाद, वांछित मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए उचित कोण पर प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को पकड़ें, कैथोड उस क्षेत्र का सामना कर रहा है जहां डीएनए हस्तांतरण का इरादा है।

गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में, गर्भाशय के सींगों को बाहर निकालने और भ्रूण को गीले धुंध पर रखने के बाद, जैसा कि पहले दिखाया गया था, गर्भाशय के अंदर भ्रूण को धीरे-धीरे घुमाने के लिए उंगलियों का उपयोग करें जब तक कि लैम्बडोइडल और सैगीटल टांके स्थित न हों। फिर ध्यान से गर्भाशय की दीवार और भ्रूण खोपड़ी के माध्यम से डीएनए फास्ट ग्रीन मिक्स वाले ग्लास केशिका को पार्श्व वेंट्रिकल में डालें, और डीएनए प्लास्मिड मिश्रण के दो से तीन माइक्रोलीटर को या तो एक या दोनों वेंट्रिकल में इंजेक्ट करें जैसा कि प्रति वेंट्रिकल अधिकतम दो माइक्रोलीटर के साथ वांछित है। इंजेक्शन के बाद, प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को उचित कोण पर पकड़ें ताकि वांछित मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित किया जा सके, जिसमें कैथोड उस क्षेत्र का सामना कर रहा है जहां डीएनए हस्तांतरण का इरादा है।

एक बार जब सभी आवश्यक भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेट हो जाते हैं, तो गर्भाशय के सींगों को धीरे-धीरे पेट की गुहा के अंदर वापस रखने के लिए एक खारा भिगोया हुआ कपास की कली का उपयोग करें। 5-0 सीवन सामग्री का उपयोग करके मांसपेशियों और त्वचा के चीरों को सीवन करें, फिर सीवन क्लिप का उपयोग करके घाव को सुरक्षित करें, और इसे बीटाडीन के साथ छिड़ककर घाव को कीटाणुरहित करें। माउस को पुनर्प्राप्ति पिंजरे में वापस रखें और कम से कम 20 मिनट के बाद की प्रक्रिया के लिए एक दूर अवरक्त वार्मिंग प्रकाश का उपयोग करके गर्मी बनाए रखें।

भ्रूण के सिर को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे ठीक करें। फिर सिर के आधार से नाक की ओर शुरू होने वाली मिडलाइन के साथ-साथ काटकर खोपड़ी में त्वचा को हटा दें। खोपड़ी में त्वचा छील पार्श्व मस्तिष्क के लिए एक बड़ा पर्याप्त अंतराल बनाने के लिए उत्पादित किया जा करने के लिए।

अगला, मस्तिष्क को हटाने के लिए बाँझ विच्छेदन कैंची की बंद नोक को घ्राण बल्ब के नीचे शुरू करने और मस्तिष्क स्टेम की ओर बढ़ने के लिए डालें। फिर मस्तिष्क स्टेम को काट लें और मस्तिष्क के चारों ओर मेनिन्जेस के कई ढीले टुकड़ों को ट्रिम करें। एक छिद्रित चम्मच का उपयोग करके, मस्तिष्क को उठाएं और सूखे टिशू पेपर के खिलाफ चम्मच के निचले हिस्से को डब करके अतिरिक्त तरल को हटा दें।

फिर मस्तिष्क को बर्फ पर एक एगरोज डिश में रखें। इसके बाद, एक छोटे चम्मच का उपयोग करके भी ठंडा करने के लिए 10 सेकंड के लिए एगारोज़ को मिलाएं, फिर मस्तिष्क को डिश के बीच में पैंतरेबाज़ी करें, इसे पृष्ठीय पक्ष के साथ क्षैतिज रूप से रखते हुए और यह सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से सभी दिशाओं से एगारोज़ के साथ कवर किया गया है। धीरे से Vibratome वर्कस्टेशन से agarose ब्लॉक उठाओ और ऊतक कागज के खिलाफ dabbing द्वारा नीचे सूखी.

फिर मस्तिष्क के रोस्ट्रल पक्ष के साथ नमूना धारक के चिपके हुए क्षेत्र पर ब्लॉक रखें, और नमूना धारक को बर्फ पर रखें। गोंद को एक मिनट के लिए सूखने दें। कोरोनल स्लाइस में मस्तिष्क को 15 डिग्री के कोण पर काटें।

फिर साफ स्पैटुला का उपयोग करके, मस्तिष्क के स्लाइस को इकट्ठा करें और उन्हें एक पीटीएफई झिल्ली पर रखें जो पैराफिन का उपयोग करके 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम डिश में स्थिर हो जाती है। प्रति झिल्ली पांच मस्तिष्क स्लाइस तक इकट्ठा करें। इसके बाद, एक 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके झिल्ली पर स्लाइस के चारों ओर से अतिरिक्त एचबीएसएस ग्लूकोज समाधान को हटा दें, जिससे स्लाइस अर्ध सूखा हो जाता है, फिर झिल्ली के नीचे अंतरिक्ष में सीधे प्रीवस्ट्र्ड स्लाइस मीडिया के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस को इनक्यूबेट करें।

इमेजिंग अक्षतंतु विकास के लिए, कम से मध्यम सेल घनत्व के साथ एक प्रांतस्था क्षेत्र का पता लगाएं। जबकि इमेजिंग विकास शंकु गतिशीलता के लिए, कॉर्टेक्स के तत्काल क्षेत्र या सबवेंट्रिकुलर क्षेत्र में एक विकास शंकु का पता लगाएं। अगला एक Z स्टैक आकार निर्धारित करें।

एक बड़े जेड स्टैक में अक्षतंतु वृद्धि के लिए, दो माइक्रोमीटर का एक चरण आकार सेट करें और एक छोटे जेड स्टैक में विकास शंकु के लिए, एक माइक्रोमीटर का एक चरण आकार सेट करें। डेटा विश्लेषण के लिए, फ़िजी में फ़ाइल क्लिक करके छवि फ़ाइल खोलें, फिर खोलें, और छवि का चयन करें. छवि पर क्लिक करके समय अंतराल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्राप्त करें, इसके बाद स्टैक, जेड प्रोजेक्शन और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण।

समय चूक के माध्यम से जाओ और एक बढ़ते अक्षतंतु का पता लगाएं। एक बार स्थित होने के बाद, बढ़ते अक्षतंतु के माध्यम से एक रेखा खींचें, पहले फ्रेम में अक्षतंतु की नोक से शुरू करें और पूरे समय अंतराल के माध्यम से अक्षतंतु का पालन करें। अगला, प्लगइन kymo फिर से टुकड़ा चौड़ा गाओ.

छवि पर जाकर kymograph के पैमाने को सेट करें, फिर गुण। माइक्रोमीटर में दूरी सेट करने के बाद, और पिक्सेल चौड़ाई और सेकंड या मिनट में समय, और पिक्सेल ऊंचाई, विश्लेषण करने के लिए और माप पर क्लिक करें। वृद्धि शंकु की मात्रा को मापने के लिए, छवि फ़ाइल को फ़ाइल पर क्लिक करके, खोलकर, और रुचि की फ़ाइल का चयन करके छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में खोलें.

उसके बाद, एल्गोरिथ्म सेटिंग्स के तहत, चरण एक में नई सतहों को जोड़ें विज़ार्ड का चयन करें, केवल रुचि के क्षेत्र का चयन करें, और चरण दो में, सभी फ़्रेम में संपूर्ण विकास शंकु को फिट करने के लिए फ़्रेम को क्रॉप करें। चरण तीन में अगला, थ्रेशोल्डिंग को पूर्ण तीव्रता तक रखें और चरण चार में, सुनिश्चित करें कि पूरे विकास शंकु क्षेत्र को थ्रेशोल्ड किया गया है। फिर चरण पांच में, फ़िल्टर प्रकार के तहत voxels LMG की संख्या का चयन करें एक करने के लिए।

सभी निर्माण चरणों को निष्पादित करने के लिए निष्पादन बटन का चयन करें और नई सतहों को जोड़ें विज़ार्ड को समाप्त करें। अंत में, विज़ार्ड विंडो के शीर्ष पर स्थित आँकड़े टैब में, विस्तृत टैब के अंतर्गत विशिष्ट मानों और वॉल्यूम का चयन करें. आमतौर पर, सफलतापूर्वक सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस या तो गर्भाशय या पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में सामान्य सेलुलर वितरण और एपिकली उन्मुख पिलो-संपर्क प्रक्रियाओं के साथ रेडियल ग्लिया की एक संगठित सरणी दिखाते हैं।

कभी-कभी रेडियल ग्लियाल मचान और सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस में एक पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन चिह्नित गड़बड़ी देखी जाती है जो इस नियंत्रण को धुंधला करने योग्य बनाती है। एक प्रतिनिधि पिरामिड कॉर्टिकल प्रोजेक्टिंग न्यूरॉन Lyn-mNeonGreen और इसके विकास शंकु के गतिशील व्यवहार को व्यक्त करने के लिए यहाँ दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स को एक प्लास्मिड का उपयोग करके लेबल किया गया था, जो सीटू में चेताक्षीय विकास शंकु की एक्टिन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक्टिन जांच को व्यक्त करता है।

सीटू प्रयोगों में प्लास्मिड डिजाइन को व्यक्त करने वाले दोहरे क्रे ड्रे फ्लोरोफोर के साथ भी प्रदर्शन किया गया था, जहां टीआरएफपी या जेडजीआरईन फ्लोरोफोर्स को विशेष रूप से और व्यक्तिगत रूप से पड़ोसी न्यूरॉन्स में क्रमशः ड्रे या क्रे रिकॉम्बिनेस द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। Kymographs से, गतिशील विकास पैरामीटर जैसे कई अक्षतंतुओं के लिए विकास की गति और समय के साथ विकास शंकु की मात्रा आसानी से प्राप्त की जाती है। इसका उपयोग एक्टिन ट्रेडमिलिंग की गति और विकास शंकु की खोज गतिविधि के दौरान फिलोपोडिया और लैमेलापोडिया के बीच संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

विरल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क संरचना और ठीक धुन प्लास्मिड सांद्रता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यह कॉर्टेक्स में अक्षतंतु और विकास शंकु के सटीक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए महत्वपूर्ण है। चयनित प्लाज्मा और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर, यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को न्यूरॉन्स या उस वातावरण को संशोधित करने की अनुमति देता है जिसमें वे अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देते हैं।

सीटू में न्यूरॉन्स के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन पहुंच को सक्षम करके, यह तकनीक न्यूरोसाइंटिस्ट्स को रूपात्मक और आणविक दोनों स्तरों पर विकास शंकु और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मैट्रिक्स के बीच गतिशील बातचीत से पूछताछ करने में सक्षम बनाती है।