El conocimiento de la biodisponibilidad del hierro es esencial para la evaluación de la calidad nutricional del hierro en los alimentos. El bioensayo de células Caco-2 fue desarrollado para satisfacer esta necesidad crítica de investigación. Este bioensayo es un enfoque rentable y de alto rendimiento para determinar la biodisponibilidad de hierro de diferentes dietas.
Se puede utilizar para caracterizar los factores que influyen en la biodisponibilidad del hierro y refinar los objetivos del estudio in vivo. Demostrando el procedimiento estará Yongpei Chang, un técnico de investigación de mi laboratorio. Para comenzar, cultive las células Caco-2 durante 7 a 10 días, y una vez que haya suficientes células disponibles, siembre las células en un matraz no recubierto de colágeno.
Luego cultive las células en frascos durante siete días y cambie el medio en un día alterno. En el séptimo día, use las celdas para sembrar las placas de múltiples pocillos. Sembrar las células Caco-2 a una densidad de 50, 000 células por centímetro cuadrado en seis placas recubiertas de colágeno de pozo.
Agregue DMEM suplementado con HEPES, FBS y solución antimicótica antibiótica al 1% a las placas. Luego incubar durante 12 días a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Siga cambiando el medio al menos cada dos días en un horario diario constante.
Luego prepare un medio esencial mínimo suplementado con tuberías, solución antimicótica antibiótica, hidrocortisona, insulina, selenio, triyodotironina y factor de crecimiento epidérmico. Reemplace el medio de cultivo con dos mililitros de este medio preparado. Al día siguiente, reemplácelo con un mililitro del medio esencial mínimo a pH 7.
Ahora cree un anillo de inserción esterilizado utilizando una junta tórica de silicona equipada con una membrana de diálisis lavada con ácido. En el día 13, retire los insertos del refrigerador, drene y reemplace el agua con ácido clorhídrico molar 0.5. Déjelo en una campana de flujo laminar durante al menos una hora antes de usarlo.
Luego drene el ácido clorhídrico molar 0.5 y enjuague con agua estéril de 18 megaohmios. Almacene en agua estéril de 18 megaohmios en una campana de flujo laminar hasta que esté listo para usar. Cree un sistema de dos cámaras insertando un anillo en los pocillos que contienen las células de la placa de seis pocillos y luego devuelva la placa con los insertos a la incubadora.
Para preparar la solución pancreatina-bilis, agregue 87.5 gramos de resina de intercambio catiónico débil a la pancreatina solubilizada y al extracto biliar y use un agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente para mezclar los componentes. Vierta la suspensión en una columna grande y escurra la columna. Luego centrifugar el eluyente de la columna.
Pesar la muestra en un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros. Ajustar el pH con ácido clorhídrico y añadir 10 mililitros de solución salina fisiológica que contiene 140 milimolares de cloruro de sodio y cinco milimolares de cloruro de potasio. Luego configure el proceso de digestión gástrica agregando 0.5 mililitros de la solución de pepsina porcina preparada a la muestra.
A continuación, incubar en una coctelera oscilante a un ajuste suave durante una hora a 37 grados centígrados e iniciar el proceso de digestión intestinal de cada muestra ajustando el pH a 5,5 a 6,0 con 1,0 molar de bicarbonato de sodio. Agregue 2.5 mililitros de la solución biliar de pancreatina a cada tubo de muestra y ajuste el pH a 6.9 a 7.0 con bicarbonato de sodio molar 1.0. Usando la solución que contiene 140 cloruro de sodio milimolar y cinco cloruro de potasio milimolar, agregue líquidos para que cada tubo contenga exactamente 15 gramos de material total.
Ahora transfiera 1,5 mililitros de cada digestión intestinal a la cámara superior del pozo que contiene las células Caco-2 de la placa de cultivo de seis pozos. Reemplace la tapa de la placa e incube a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% en una coctelera oscilante a seis oscilaciones por minuto durante dos horas. Retire el anillo de inserción con el resumen.
Luego agregue un mililitro de medio esencial mínimo a pH 7 a cada pocillo y mantenga la placa en la incubadora durante 22 horas. Ahora retire el medio de cultivo celular y agregue dos mililitros de agua de 18 megaohmios a la capa mono celular. Transfiéralo a un sonicador y recolecte todo el lisado celular en tubos de microcentrífuga para análisis de proteínas celulares y ferritina celular.
Las variedades de manteca mostraron una mayor disponibilidad de hierro en relación con los controles de referencia de las clases de color modelo blanco y rojo durante dos años consecutivos de cosecha. La biodisponibilidad de hierro de las variedades de frijol blanco y amarillo mostró un aumento después de procesarlos en harina. Sin embargo, la biodisponibilidad del hierro mostró una disminución en las variedades de arándano, riñón rojo y negro.
El cultivo adecuado de células monocapa de Caco-2 es esencial para el uso exitoso de este bioensayo. La atención precisa a los detalles del crecimiento y el mantenimiento es clave para la respuesta consistente del bioensayo. Este modelo niega las desventajas y el alto costo de otros enfoques y permite a los investigadores identificar mecanismos y evaluar más completamente los factores que inhiben y promueven la biodisponibilidad del hierro.
