JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.

Abstract

ضوء يتوسط مجموعة من العمليات التنموية والتكيف في جميع مراحل دورة حياة النبات. النباتات التي تمتص ضوء الاستفادة من جزيئات تسمى المستقبلات الضوئية الى الحس والتكيف مع الضوء. الأحمر / بعيدة الضوء الأحمر التي تمتص مبصرات فيتوكروم قد درست بشكل واسع. Phytochromes وجود له عائلة من البروتينات ذات وظائف مختلفة ومتداخلة في جميع النظم في النباتات الراقية التي تم دراستها

Protocol

1. نمو النبات

  1. وأكد UAS - X الفخ BVR محسن GAL4 - GFP خط معزولة كما هو موضح 4 (للحصول على ملخص انظر الشكل 1) ، وزرعت خطوط من النوع البري أو الأبوية في التربة ، أي ~ 2000 البذور المعقمة في كل سطر.
  2. وتزرع النباتات لمدة 5 أسابيع في التربة تحت إضاءة بيضاء من 100 ق -2 μmolm -1 في 22 درجة مئوية والرطوبة 70 ٪.

2. الجبلة المجردة أوراق العزلة (مقتبس من Denecke وفيتالي 9)

  1. لعزل protoplasts ، وإعداد TEX العازلة. : 1 ليتر TEX العازلة ، وتزن من العناصر التالية : 3.1 أملاح ز B5 Gamborg و0.5 غرام 2 -- (N - morpholino) ethanesulfonic حمض (MES ، 2.56 ملم) ، 0.75 كلوريد الكالسيوم ز ثنائي الهيدروكسيل (CaCl 2 0.2 H 2 O ، 6.75 مم) ، 0.25 جرام نترات الامونيوم (NH 4 NO 3 ، 3.12 ملم) ، 136.9 غرام السكروز (0.4M). يذوب تماما في مكونات مل 900 ~ من الماء ، منزوع الأيونات المقطر (DDH 2 O) وجلب الرقم الهيدروجيني إلى 5.7 مع 1 M KOH. جلب الحجم النهائي إلى 1 ليتر وفلتر مع فلتر تعقيم زجاجة أعلى 0.2 ميكرون متصلة مضخة فراغ.
  2. ثم جمع الخضراء ، وأوراق صحية من النباتات (~ 250 مل من أوراق فضفاضة معبأة في كوب) وشطف مع ~ 40 مل DDH 2 4 مرات O ، وذلك بدهن مرتين مع العقيمة O. 2 DDH # 20 باستخدام مشرط ، وأوراق مقطعة إلى شرائح رقيقة ويقسم الى قسمين بالتساوي نسيج أنابيب بلاستيكية معقمة 50 مل. إعداد ورقة 1X خليط الهضم عن طريق إضافة 5 مل من قسامة 10X أوراق الهضم حل الأوراق المالية (الأسهم 10X الهضم أوراق الحل : حل 2 ٪ W / V Macerozyme R - 10 ، و 4 ٪ ث / ت سلولاز "Onozuka" R - 10 في المخزن تكس ، فلتر تعقيم مع 0.2 ميكرون تصفية وتجميد aliquots 5 مل في -80 درجة مئوية) إلى 45 مل العازلة TEX الطازجة. ~ إضافة 25 مل من مزيج 1X أوراق الهضم لكل 50 مل أنبوب لتغطية جميع أنسجة نبات.
  3. فراغ اختراق الأنسجة لأوراق الشجر في خليط الهضم في أنابيب مفتوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف فراغ متصلة بجهاز ضخ المياه تليها 3 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز مع اهتزاز لطيف. يتم الاحتفاظ أنابيب ملفوفة توج مع الأنسجة ورقة نبات في 1X مزيج الهضم في رقائق الألومنيوم خلال هذه العملية لمنع التعرض للضوء.
  4. بعد 3 ساعات ، وزيادة سرعة الروك دقائق 2 ~ لاطلاق سراح protoplasts. تصفية تعليق الجبلة المجردة الخام من خلال طبقتين من القماش الجبن المعقم لإزالة الحطام وجمع الراشح في دورق زجاجي معقم. تصفية الترشيح من خلال شبكة من النايلون العقيمة 100 ميكرومتر في طبق بتري معقمة. تدفق من خلال جمع ونقل إلى جديدة معقمة أنبوب 50 مل. استخدام حوالي 15-20 مل من TEX عازلة جديدة لغسل صحن بتري معقمة وجمع أي protoplasts الانضمام إلى السطح.
  5. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق باستخدام الدوار دلو أرجوحة في 100xg على 10 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (6 تسريع ، التباطؤ 0).
  6. إزالة ~ 25-30 مل من السائل تحت طبقة عائمة الجبلة المجردة ، والتي تحتوي على الحطام المتبقي ومكعبات ، مع العقيمة 9 "ماصة باستير الزجاج متصلة مضخة تمعجية دون الإخلال الجبلة المجردة طبقة عائمة ، وترك ~ 10-15 حجم مل.
  7. إضافة جديدة TEX العازلة إلى الحجم النهائي من 40 مل في حين أن إعادة التعليق بلطف protoplasts.
  8. كرر الخطوات من 2،5-2،7 مرتين لازالة الحطام الخلوية إلى أقصى حد ممكن. يتم تقليل الوقت الطرد المركزي الى 10 دقيقة في التكرار الأول وعلى بعد 5 دقائق في تكرار النهائي.
  9. نضح protoplasts العائمة مع قص ، نقل مل ماصة معقمة 1 في أنبوب جديد 15 مل. الانتقال مباشرة إلى الفرز أو تخزينها في الظلام لمدة تصل الى 2 ساعة في 4 درجات مئوية حتى الفرز.

3. الجبلة المجردة من قبل الفرز الفرز الخلية الإسفار المنشط (FACS)

  1. قبل الفرز ، ودراسة ليزر متحد البؤر protoplasts بواسطة الميكروسكوب الضوئي (CLSM) باستخدام الليزر 488 نانومتر عن الإثارة لتأكيد سلامة الجبلة المجردة ووجود مضان GFP في تجمع الجبلة المجردة. الحطام الحد الأدنى الضروري لتجنب انسداد فوهة الفرز FACS.
  2. protoplasts فرز معزولة في المخزن TEX عبر FACS دينار بحريني (FACSVantage SE ، العلوم البيولوجية دينار بحريني) باستخدام فوهة 200 ميكرومتر على رأس الفرز الكلي بمعدلات حدث بين 6000 و 15000 ، مع ضغط نظام رطل 9 التالية حول بروتوكول تكييف 10.
  3. وتستخدم من النوع البري غير GFP protoplasts لتحديد عتبات تألق ذاتي.
  4. لجمع GFP protoplasts إيجابية ، والخلايا باستخدام نوع تبريد الهواء الأرجون ليزر (أطياف الفيزياء الموديل 177 ، شركة نيوبورت ، ايرفين ، كاليفورنيا) تعمل في 100 ميغاواط على خط الأرجون 488 نانومتر لتحديد GFP مضان باستخدام الموجات 530/30 تمرير التصفية.
  5. بعد جمع GFP إيجابية protoplasts ، مرتبة حسب دراسة protoplasts CLSM كما هو مفصل في خطوة 3.1.
  6. استخراج الحمض النووي الريبي من مجموع protoplasts فرزها باستخدام النباتات RNeasy Qiagen ميني كيت. [كدنا] ويمكن عندئذ أن تكون مستعدة لالتهجين كما هو موضح في Affymetrix GeneChip Expression دليل التحليل الفني ومن ثم المهجنة لATH1 Arabidopsis صفائف Affymetrix الجينوم.

ممثل النتائج

رصدنا عددا كبيرا من الخلايا GFP إيجابية في القناة التي GFP FACS (الشكل 2). في المقايسات الأمثل باستخدام GFP محسن شرك الآباء وconstitutively GFP - معربا عن الخط ، J0571 ، عرض ~ 17 ٪ إلى 24 ٪ GFP protoplasts إيجابية ، في حين أن التعبير تمشيا مع الأوعية الدموية والجلد ، J1071 ، كان ~ 1.4 ٪ GFP إيجابية protoplasts (الجدول 1). فرز 3 ميكرولتر 500 × (~ مجموعه 1.5 مل من تعليق الجبلة المجردة) من J0571 protoplasts : 1 أعطى ~ ح 100000 GFP protoplasts إيجابية. فرز 3 ميكرولتر 500 × (~ 1.5 مل تعليق الجبلة المجردة الكل) من J1071 protoplasts مقابل 1.5 ح أعطى ~ 3000 GFP protoplasts إيجابية. وأشارت صور مبائر غلات عالية جدا من protoplasts لعينات كلا J0571 J1071 وقبل أن يتم الفرز على (الشكل 3C و3E) ، والكسور فرز الواردة مشرق فقط GFP - protoplasts فلوري (3G الشكل والبيانات لا تظهر). يؤكد هذا الاستنتاج يمكن أن فرز سليمة GFP إيجابية protoplasts عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية. يمكن أيضا أن protoplasts غير GFP يمكن فرز وجمع في قناة منفصلة. وprotoplasts غير GFP بمثابة سيطرة على سلبية لتحاليل مثالية ميكروأري اللاحقة للكشف عن تغيرات محددة في التعبير الجيني على خفض مستويات holophytochrome. الاستخراج من الحمض النووي الريبي protoplasts معزولة (1 مل) من الحمض النووي الريبي غلة كمية كافية من أجل الكشف عن طريق fluorospectrometry (الشكل 4). وجرى تقييم معزولة RNA باستخدام أداة NanoDrop (NanoDrop 1000 ، الحرارية العلمية) وكميا بواسطة NanoDrop 3.7.1 برنامج الكمي الحمض النووي الريبي. غلة من الحمض النووي الريبي قبل فرزها C24 من النوع البري أو protoplasts FACS - فرزها ، GFP إيجابية protoplasts فخ محسن تجاوز الحد الأدنى من 20 نانوغرام اللازمة لاستخدام الحمض النووي الريبي لوضع العلامات المقايسات ميكروأري (الجدول 2).

محسن فخ الخط ٪ من GFP إيجابية protoplasts عدد protoplasts فرز GFP
J0571 17.18 ٪ 24.06 ٪ ~ 26400 ~ 36000
J1071 ~ 1.43 ٪ 1000 ~ 1300

الجدول 1. النسبة المئوية للGFP إيجابية protoplasts من سطرين فخ محسن قبل الفرز وعدد GFP إيجابية protoplasts جمعها عن طريق تشغيل 500 ميكرولتر من الجبلة المجردة من خلال تعليق فارز الإسفار خلية المنشط (FACSVantage ، دينار بحريني).

مصنع الخط RNA الغلة (نغ)
C24 WT 12486،5
J0571 60
J1071 71.5

الجدول 2. الربح من العزلة من الحمض النووي الريبي protoplasts. تم عزل الحمض النووي الريبي من قبل فرزها C24 protoplasts GFP إيجابية من النوع البري أو فرزها من سطرين فخ محسن وكميا.

figure-protocol-8662
الشكل 1. GAL4 محسن شرك القائم على تحريض اختزال بيليفيردين (BVR) النباتات المعدلة وراثيا في التعبير thaliana Arabidopsis. (A). يمكن أن يعبروا الفردية مختارة من مكتبة GAL4 المستندة إلى خطوط فخ محسن ، والتي تحتوي على علامة GFP GAL4 تستجيب للجينات ، مع خط يحتوي على الجينات التي تستجيب للهدف GAL4 للحث على التعبير عن الجينات المستهدفة في الخلايا التي تحتوي على GAL4 ملحوظ بواسطة GFP مضان. بناء على الرقم من الدكتور جيم Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (ب) إنتاج حامل اللون فيتوكروم ، phytochromobilin (PΦB) وخطوط holophytochrome في الأصل. (C) يسار ، تخفيض IXα بيليفيردين (BV IXα) وPΦB بواسطة اختزال بيليفيردين (BVR) النشاط BR وPΦR ، على التوالي. holophytochrome نتائج النشاط BVR في استنزاف PΦB ويؤدي إلى انخفاض في إنتاج متفاعل للضوء. الحق ، ويظهر رد الفعل التي حفزتها BVR.

figure-protocol-9658
الشكل 2. الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) مؤامرات نقطة الشراء. مقارنة بين الخلية الجبلة المجردة الفرز لنوع C24 البرية (A) ، J0571 (B) و J1071 (C). (أ) مؤامرة نقطة اقتناء غير GFP protoplasts الفلورسنت البرية من نوع C24 ولع ليزر الأرجون 488 نانومتر ، ويستخدم لتحديد عتبة تألق ذاتي. (ب) و (ج) اقتناء قطع نقطة تظهر نسب protoplasts التي GFP ايجابية ردا على الإثارة التي كتبها ليزر 488 نانومتر. R3 بوابات الفرز في وباء وجيم ترسيم الأهداف GFP - الإيجابية التي تم فرزها بواسطة فارز الخلايا الإسفار المنشط (FACSVantage ، دينار بحريني) والتي تم جمعها. أحمر يشير إلى قناة الخامسalues ​​للتألق ذاتي من الكلوروفيل وprotoplasts قناة خضراء تشير قيم مضان GFP.

figure-protocol-10459
الشكل 3. متحد البؤر المجهري للprotoplasts النباتية المستخدمة لفرز الخلايا. تفحص صورا ليزر متحد البؤر protoplasts قبل (A ، C ، E) وبعد (G) الفرز عن طريق خلية فارز الإسفار المنشط (FACS). B ، D و F و H هي صور مدينة دبي للإنترنت. وترد Protoplasts من نوع C24 البرية (A ، B) ، J1071 (C ، D) وJ0571 (E ، F ، G ، H). يتم دمج الصور C ، E ومجموعة صور لمضان GFP (BP 505 نانومتر -- 575 نانومتر) ، وتألق ذاتي (LP 650 نانومتر) التي تم الحصول عليها من الإثارة مع ليزر 488 نانومتر. A إلى H هي متوسط ​​4 بفحص النفط تحت 63x. بار = 10 ميكرومتر.

figure-protocol-11140
الشكل 4. الكمي من الحمض النووي الريبي معزولة عن protoplasts بواسطة fluorospectrometry. الحمض النووي الريبي المستخرج من نوع C24 (A) البرية ، (B) J0571 و J1071 (C). ويشير الجيش الملكي النيبالي لمرحلة ما قبل فرز protoplasts من النوع البري. B و C تشير RNA إيجابية من GFP protoplasts مرتبة حسب الفرز الخلية الإسفار المنشط (FACS). RNA البرمجيات الكمي ، NanoDrop 3.7.1 (NanoDrop 1000 ، الحرارية العلمية).

Discussion

التنميط الجيني التعبير من خلال ميكروأرس (1) وأشارت إلى أن أكثر من 30 ٪ من الجينات في الشتلات Arabidopsis خفيفة وتنظيم 11 (2) وحددت مجموعة واسعة من جينات البروتينات الخفيفة ترميز نقل الإشارة المشاركة في تتالي إشارات فيتوكروم 12 و 13 . مثل هذه التجارب تشير إلى أن يدفع ضو...

Acknowledgements

ويدعم العمل في المختبر مونتغمري على ردود فيتوكروم في النباتات من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (منحة رقم 0919100 للMCB - بلم) ، والعلوم الكيميائية ، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة ، ومكتب للعلوم الأساسية للطاقة ، ومكتب العلوم الأميركية ، وإدارة الطاقة (منحة رقم DE FG02 91ER20021 إلى بلم). نشكر ميليسا ويتيكر لتقديم المساعدة التقنية أثناء التصوير وقراءة نقدية للمخطوطة ، وستيفاني Costigan للحصول على المساعدة التجريبية ، والدكتور لويس الملك للمساعدة في تطوير وتحسين الإسفار المنشط خلية بروتوكولات لفرز الفرز الجبلة المجردة Arabidopsis والدكتور الإطار ميليندا للحصول على مساعدة مبائر المجهري. نشكر مارلين كاميرون عن المساعدة في التصميم الرسومية وكارين بيرد للمساعدة التحرير.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-BVR antibodyQED Bioscience Inc.56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10SERVA ElectrophoresisMSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixtureSigma-AldrichG5768
Macerozyme R-10SERVA ElectrophoresisPTC 001
MES, low moisture contentSigma-AldrichM3671
Murashige and Skoog saltsCaisson Laboratories74904
PhytablendCaisson Laboratories28302
RNeasy Plant MinikitQiagen16419

References

  1. Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
  2. Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
  3. Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
  4. Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
  5. Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
  6. Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
  7. Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
  8. Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
  9. Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
  10. Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
  11. Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
  12. Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
  13. Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
  14. Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
  15. Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
  16. Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

39 thaliana Arabidopsis FACS protoplasting

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved