חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Summary

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

Abstract

מתווכת אור מערך של תהליכים התפתחותיים אדפטיבית לאורך כל מחזור החיים של צמח. צמחים לנצל אור קליטת מולקולות בשם photoreceptors לחוש ולהתאים לאור. אדום / מרחיקות אדום אור קליטת photoreceptors phytochrome נחקרו רבות. Phytochromes להתקיים כמשפחה עם פונקציות של חלבונים שונים וחופפים בכל המערכות צמח גבוה שבו הם נחקרו

Protocol

1. הצמח צמיחה

1. אושר כטב"מ-BVR GAL4 X-GFP קו משפר מלכודת מבודד כמתואר ⁴ (לסיכום ראו איור. 1) וקווי wild-type או ההורים נזרעים על קרקע, כלומר ~ 2000 זרעים מעוקרים בכל שורה.
2. צמחים גדלים במשך 5 שבועות על אדמת תחת תאורה לבנה של 100 μmolm ^-2 s ^-1 ב 22 ° C ו 70% לחות.

2. ליף Protoplast בידוד (עיבוד Denecke ו Vitale ⁹⁾

1. כדי לבודד protoplasts, להכין TEX חיץ. עבור חיץ 1 ליטר TEX, לשקול את הרכיבים הבאים: 3.1 גרם של Gamborg B5 מלחים, 0.5 גר '2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES, 2.56 מ"מ), 0.75 כלוריד גרם סידן dihydrate (CaCl ₂ .2 H ₂ O, 6.75 מ"מ), 0.25 גרם אמוניום חנקתי (NH ₄ NO _3, 3.12 מ"מ), סוכרוז 136.9 גרם (0.4M). להמיס מרכיבים לחלוטין ~ 900 מ"ל מים מזוקקים deionized (DDH ₂ O) ולהביא את רמת החומציות ל 5.7 עם 1 M KOH. תביאו נפח סופי 1 ליטר ולסנן לעקר עם בקבוק העליונה לסנן 0.2 מיקרומטר מחוברת משאבת ואקום.
2. איסוף ירוק, עלים בריא מצמחים (~ 250 מ"ל של עלים ארוזים בצורה רופפת בכוס) ולשטוף עם ~ 40 מ"ל DDH ₂ O 4 פעמים, ואחריו שטיפה פעמיים עם סטרילי DDH ₂ O. באמצעות # 20 אזמל, עלים לחתוך לרצועות דקות ומחלקים רקמות שווה לשני 50 מ"ל סטרילי צינורות פלסטיק. הכינו תערובת עלים 1x העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של aliquot העיכול 10x פתרון המניות עלה (עלה 10x העיכול פתרון המניות: להמיס 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v cellulase "Onozuka" R-10 ב TEX חיץ, מסנן לעקר עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהקפיא aliquots 5 מ"ל ב -80 ° C) עד 45 חיץ טרי מ"ל TEX. הוסף ~ 25 מ"ל של תערובת 1x עלה לעיכול לכל שפופרת 50 מ"ל כדי לכסות את כל רקמת העלה.
3. אבק לחדור לרקמות עלה בתערובת עיכול צינורות פתוחים שעות 1 בטמפרטורת החדר באמצעות ייבוש ואקום מחוברת משאבת מים ואחריו הדגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עם רעד עדין. צינורות כתרים עם רקמת עלה בתמהיל עלה 1x העיכול נשמרים עטוף בנייר אלומיניום במהלך תהליך זה, כדי למנוע חשיפה לאור.
4. אחרי 3 שעות, להגדיל את מהירות הנדנדה ~ 2 דקות כדי לשחרר protoplasts. סנן את ההשעיה protoplast גולמי באמצעות שתי שכבות של בד גבינה סטרילי להסיר פסולת ולאסוף את תסנין בכוס כוס סטרילית. סינון תסנין באמצעות רשת של 100 מיקרומטר סטרילי ניילון לתוך צלחת פטרי סטרילית. איסוף לזרום ולהעביר אותו צינור חדש 50 מ"ל סטרילי. השתמש בערך 15-20 מ"ל של חיץ TEX טרי לשטוף את צלחת פטרי סטרילית ולאסוף כל protoplasts דבקות אל פני השטח.
5. צנטריפוגה את הזרימה דרך הרוטור באמצעות דלי הנדנדה ב 100xg על 10 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (האצת 6, להאטת 0).
6. הסר ~ 25-30 מ"ל של הנוזל מתחת לשכבת protoplast צף, אשר מכיל שיירי פסולת ו pelleted, עם סטרילית 9 "זכוכית פסטר פיפטה מחוברת משאבה peristaltic מבלי להפריע את השכבה protoplast צף והשארת ~ 10-15 נפח מ"ל.
7. הוסף חוצץ חדש TEX לנפח סופי של 40 מ"ל בזמן בעדינות resuspending protoplasts.
8. חזור על שלבים 2.5-2.7 פעמיים כדי להסיר שאריות הסלולר כמה שיותר. השעה צנטריפוגה מצטמצם 10 דקות החזרה הראשונה עד 5 דקות חזרה הסופי.
9. לשאוב protoplasts צף עם חתך, פיפטה סטרילית 1 מ"ל להעביר לתוך שפופרת 15 מ"ל חדש. המשך ישר למיון או לאחסן בחושך עד 2 שעות 4 ° C עד המיון.

3. Protoplast מיון לפי מיון הקרינה המופעל תא (FACS)

1. לפני מיון, לבחון protoplasts ידי מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) באמצעות לייזר 488 ננומטר עבור עירור לאשר שלמות protoplast ואת הנוכחות של ה-GFP הקרינה בבריכה protoplast. פסולת מינימלי הכרחי כדי למנוע סתימת הנחיר FACS מיון.
2. מיין protoplasts מבודד TEX חיץ באמצעות FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) באמצעות זרבובית 200 מיקרומטר על ראשו מעין מאקרו בשיעורים אירוע בין 6000 ו - 15000, עם לחץ מערכת של סביב 9 psi בעקבות פרוטוקול מותאם ^10.
3. Wild-type GFP protoplasts שאינם משמשים כדי לקבוע את ספי autofluorescence.
4. כדי לאסוף GFP חיובי protoplasts, סוג התאים באמצעות מקורר אוויר ארגון לייזר (ספקטרה לפיסיקה דגם 177, ניופורט Corporation, אירווין, קליפורניה) פעלו mW 100 בקו ארגון 488 ננומטר לזהות GFP הקרינה באמצעות הלהקה 530/30 עוברים סינון.
5. בעקבות אוסף ה-GFP חיובי protoplasts, לבחון protoplasts מיון לפי CLSM כמפורט צעד 3.1.
6. תמצית RNA הכולל protoplasts מיון באמצעות RNeasy Qiagen קיט מיני צמחים. cDNA אז יכול להיות מוכן הכלאה כמתואר Affymetrix GeneChip Exprניתוח טכני ession ידנית ואז הכלאה כדי AtH1 מערכים ארבידופסיס Affymetrix הגנום כולו.

נציג תוצאות

גילינו מספר משמעותי של ה-GFP חיובי תאים בערוץ ה-GFP על ידי FACS (איור 2). ב מבחני אופטימיזציה באמצעות GFP-משפר מלכודת ההורים, constitutively GFP-לבטא קו, J0571, מוצג ~ 17% עד 24% GFP חיובי protoplasts, ואילו קו עם הביטוי של כלי הדם ואת עורי, J1071, היה ~ 1.4% GFP חיובי protoplasts (טבלה 1). מיון של μl 500 x 3 (~ 1.5 סך של השעיה protoplast מ"ל) של J0571 protoplasts עבור 1 ש נתן ~ 100,000 GFP חיובי protoplasts. מיון של μl 500 x 3 (~ 1.5 השעיה protoplast מ"ל סה"כ) של J1071 protoplasts עבור 1.5 שעות נתן ~ 3000 GFP חיובי protoplasts. תמונות Confocal הצביעו על תשואה גבוהה מאוד של protoplasts עבור דגימות הן J0571 ו J1071 לפני המיון בוצעה (איור 3C ו 3E), וכן שברים מיון הכלול בהיר רק GFP-פלורסנט protoplasts (איור 3G ו מידע לא מוצג). ממצא זה מאשר כי פגע GFP חיובי protoplasts ניתן למיין באמצעות FACS. לא ה-GFP protoplasts ניתן גם למיין ואסף בערוץ נפרד. הלא GFP protoplasts לשמש מלאה שלילי אידיאלי עבור מנתח microarray הבאים כדי לזהות שינויים ספציפיים ביטוי גנים על הפחתת רמות holophytochrome. RNA חילוץ מתוך protoplasts מבודדים (1 מ"ל) תשואות של RNA בכמות מספקת לגילוי על ידי fluorospectrometry (איור 4). מבודדים רנ"א הוערכה באמצעות מכשיר NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) לכמת ידי תוכנת NanoDrop RNA 3.7.1 כימות. התשואות RNA מן טרום מיון C24 wild-type protoplasts או FACS, מיון, GFP חיובי protoplasts משפר מלכודת חרג מינימום 20 ng צורך לשימוש ב-RNA-תיוג מבחני עבור microarray (טבלה 2).

Enhancer קו מלכודת	% של ה-GFP חיובי protoplasts	מספר protoplasts GFP מיון
J0571	17.18% ~ 24.06%	26,400 ~ 36,000
J1071	~ 1.43%	1000 ~ 1300

טבלה 1. אחוז GFP חיובי protoplasts משתי שורות משפר מלכודת לפני למיון מספר GFP חיובי protoplasts שנאספו על ידי הפעלת 500 μL ההשעיה protoplast באמצעות סדרן Cell הקרינה הופעל (FACSVantage, BD).

הצמח קו	RNA תשואה (ng)
C24 WT	12486.5
J0571	60
J1071	71.5

טבלה 2. תשואה מהבידוד RNA מן protoplasts. RNA היה מבודד טרום מיון C24-GFP חיובי protoplasts wild-type או מיון של שתי שורות משפר מלכודת לכימות.

באיור 1. GAL4 משפר-מלכודת מבוססי אינדוקציה של Biliverdin רדוקטאז (BVR) ביטוי הצמחים הטרנסגניים thaliana ארבידופסיס. (א). בודדים נבחרים מספריה של GAL4 מבוססי קווי משפר מלכודת, אשר מכילים GAL4 מגיב סמן גן ה-GFP, ניתן חצה קו המכיל את הגן GAL4 מגיב מטרה לגרום הביטוי של הגן היעד GAL4 המכיל תאים מסומנים על ידי ה-GFP פלואורסצנטי. מבוסס על דמות של ד"ר ג'ים Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (ב) הפקה של phytochrome chromophore, phytochromobilin (PΦB) ו holophytochrome בקווים האב. (ג) משמאל, הפחתת biliverdin IXα (BV IXα) ו PΦB ידי biliverdin רדוקטאז (BVR) פעילות BR ו PΦR, בהתאמה. תוצאות BVR פעילות דלדול PΦB ומובילה לירידה בייצור של photoactive holophytochrome. נכון, התגובה catalyzed ידי BVR מוצג.

איור 2. Cell Fluorescence מיון פעיל (FACS) נקודה רכישת חלקות. השוואה בין תא protoplast מיון עבור סוג C24 בר (א), J0571 (ב) ו J1071 (C). (א) נקודה רכישת חלקה של אי - GFP פלורסנט C24 wild-type protoplasts נרגש 488 ננומטר ארגון לייזר בשימוש כדי לקבוע סף autofluorescence. (ב) ו - (ג) נקודה מגרשים רכישת להראות הפרופורציות של protoplasts כי הם GFP חיובית בתגובה עירור על ידי לייזר 488 ננומטר. שערי מיון R3 ב B ו-C לתחום את ה-GFP חיובי מטרות שהיו מיון לפי סדרן הקרינה המופעל תא (FACSVantage, BD) ואסף. ערוץ האדום מציין values ​​עבור autofluorescence כלורופיל מ protoplasts ערוץ ירוק מציין ערכי ה-GFP פלואורסצנטי.

איור 3. מיקרוסקופיה confocal של protoplasts צמח המשמש למיון התא. Confocal לייזר סריקת תמונות של protoplasts לפני (A, C, E) לאחר מיון (G) באמצעות סדרן הקרינה המופעל תא (FACS). B, D, F ו-H הם תמונות DIC. Protoplasts מסוג C24 בר (A, B), J1071 (C, D) ו J0571 (E, F, G, H) מוצגים. תמונות C, E ו-G ימוזגו תמונות של ה-GFP פלואורסצנטי (BP 505 nm - 575 ננומטר) autofluorescence (LP 650 ננומטר) המתקבל עירור עם לייזר 488 ננומטר. באמצעות H הם ממוצע של 4 סריקות תחת שמן 63x. בר = 10 מיקרומטר.

איור 4. כימות RNA שבודד protoplasts ידי fluorospectrometry. RNA המופק מסוג C24 (A) בר, (ב) J0571, ו (ג) J1071. מציינת רנ"א עבור טרום מיון wild-type protoplasts. B ו-C מעידים RNA מ-GFP חיובי protoplasts מיון לפי מיון הקרינה המופעל תא (FACS). RNA תוכנה כימות, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

Discussion

התבטאות גנים באמצעות פרופיל microarrays (1) ציין כי יותר מ -30% מכלל הגנים שתילים ארבידופסיס הם ¹¹ מוסדר אור (2) זיהה קבוצה המכריע של הגנים המקודדים חלבונים אור הולכת אותות מעורבים phytochrome איתות מפל ^{12, 13} . ניסויים אלה מראים כי האור גורם לשינויים מהירים לטווח ארוך ביטוי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BVR antibody	QED Bioscience Inc.	56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10	SERVA Electrophoresis	MSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixture	Sigma-Aldrich	G5768
Macerozyme R-10	SERVA Electrophoresis	PTC 001
MES, low moisture content	Sigma-Aldrich	M3671
Murashige and Skoog salts	Caisson Laboratories	74904
Phytablend	Caisson Laboratories	28302
RNeasy Plant Minikit	Qiagen	16419