Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Резюме

Молекулярные основы пространственно-конкретных ответов фитохрома в настоящее время исследованы с помощью трансгенных растений, которые обладают тканей и органов конкретных фитохрома недостатков. Выделение специфических клеток выставке индуцированных фитохрома истощения хромофора по флуоресценции, активированных сортировки клеток следуют анализ микрочипов в настоящее время используется для идентификации генов, вовлеченных в пространственно-конкретных ответных фитохрома.

Аннотация

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied¹. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs². Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL4³. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent⁴. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression⁴. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta^5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception^{4, 7, 8}. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

протокол

1. Роста растений

1. Подтвержденные UAS-BVR X GAL4-GFP усилитель ловушку линии выделяли, как описано ⁴ (для резюме см. рис. 1) и дикого типа или родительских линий и посеянное на почве, т.е. ~ 2000 стерилизованных семян на линии.
2. Растения выращиваются в течение 5 недель на почве под белой подсветкой из 100 μmolm ^-2 с ^-1 при 22 ° С и влажности 70%.

2. Лист протопластов Изоляция (адаптировано из Денеке и Витале ⁹⁾

1. Для выделения протопластов, подготовить TEX буфера. За 1 буфера литр TEX, отвешивать следующие компоненты: 3,1 г Gamborg в B5 соли, 0,5 г 2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты (MES, 2,56 ммоль), 0,75 г дигидрата хлорида кальция (CaCl ₂ · 2H ₂ O, 6,75 мМ), 0,25 г нитрата аммония (NH ₄ NO _3, 3,12 мМ), 136,9 г сахарозы (0,4 М). Растворите компоненты полностью в ~ 900 мл деионизированной, дистиллированной воды (DDH ₂ O) и довести рН до 5,7 с 1 М КОН. Принесите конечного объема до 1 литра и фильтр стерилизуют при 0,2 мкм бутылку-топ фильтр связан с вакуумным насосом.
2. Сбор зеленый, здоровые листья из растений (~ 250 мл листьев свободно упакованных в стакане) и промойте ~ 40 мл DDH ₂ O 4 раза, с последующей промывкой в два раза стерильной DDH ₂ O. Использование № 20 скальпеля, нарезать листья на тонкие полоски ткани и разделить поровну на две 50 мл стерильные пробирки, пластик. Приготовьте 1х лист пищеварения смесь, добавив 5 мл аликвоту 10x лист пищеварения маточного раствора (10x лист пищеварения маточного раствора: растворить 2% вес / Macerozyme R-10, 4% вес / Целлюлаза "Onozuka" R-10 в TEX буфера, фильтр стерилизуют при 0,2 мкм и заморозить 5 мл аликвоты при -80 ° C) до 45 мл свежего буфера TEX. Добавить ~ 25 мл 1x лист пищеварения смесь на 50 мл трубку, чтобы охватить все ткани листа.
3. Вакуумные проникнуть в ткани листа пищеварения смесь в открытой трубы в течение 1 часа при комнатной температуре, используя вакуум-эксикаторе связано с водяным насосом, затем 3-часовой инкубации при комнатной температуре на рокер с осторожном встряхивании. Capped труб с ткани листа в 1x смесь пищеварения листа хранятся завернутые в алюминиевую фольгу в ходе этого процесса, чтобы предотвратить воздействие света.
4. Через 3 часа, увеличение рокер скорость ~ 2 минуты, чтобы освободить протопластов. Фильтры сырой подвески протопласт через два слоя стерильной тканью сыра для удаления мусора и сбор фильтрата в стерильном стакане стекла. Фильтры фильтрата через стерильный 100-мкм нейлоновая сетка в стерильную чашку Петри. Сбор течь через и перенести его на новые стерильные 50 мл трубки. Используйте около 15-20 мл свежего буфера TEX мыть стерильную чашку Петри и собирать протопластов присоединения к поверхности.
5. Центрифуга потока за счет использования ротора качели ведро на 100xg при 10 ° С в течение 15 мин (ускорение 6, замедление 0).
6. Удалить ~ 25 - 30 мл жидкости ниже плавающий слой протопласта, который содержит остаточные и гранулированного мусора, стерильным 9 "стеклянной пипетки Пастера подключен к перистальтического насоса, не нарушая плавающий слой протопластов и оставив ~ 10 - 15 мл.
7. Добавьте свежие буфера TEX до конечного объема 40 мл, мягко ресуспендированием протопластов.
8. Повторите шаги с 2,5 до 2,7 раза, чтобы удалить как можно больше продуктов распада клеток, как это возможно. Центрифугирования время сокращается до 10 минут в течение первого повторения и до 5 минут в финале повторения.
9. Аспирируйте плавающей протопластов с разрезом, стерильный 1 мл передачи пипетки в новый 15 мл трубки. Перейдем непосредственно к сортировке и хранить в темноте в течение до 2 часов при температуре 4 ° С до сортировки.

3. Протопластов Сортировка по флуоресценции, активированных сортировки клеток (FACS)

1. Перед сортировкой, изучить протопластов с помощью конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM) с использованием 488-нм лазером для возбуждения для подтверждения целостности протопласта и наличие флуоресценции GFP протопластов бассейн. Минимальная мусора необходимо, чтобы избежать засорения сопла FACS сортировки.
2. Сортировать изолированных протопластов в TEX буфера с помощью FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) с использованием 200-мкм сопла на макро-глава рода на случай ставок между 6000 и 15000, с системой давление около 9 фунтов на квадратный дюйм следующий адаптированный протокол ^10.
3. Дикого типа не-GFP протопластов используются для определения аутофлюоресценция порогов.
4. Для сбора GFP-положительных протопластов, сортировка клеток с использованием воздушного охлаждения аргоновый лазер (Spectra Physics модели 177, Newport Corporation, Irvine, CA) работает при 100 мВт на 488-нм линий аргона для выявления флуоресценции с помощью GFP 530/30 группы фильтр.
5. После сбора GFP-положительных протопластов, изучить отсортированы по CLSM протопластов, как описано в пункте 3.1.
6. Извлечение общей РНК из отсортированных протопластов использованием завод Qiagen RNeasy Mini Kit. кДНК могут быть подготовлены для гибридизации, как описано в Affymetrix GeneChip Expression Анализ Техническое руководство и гибридизации с AtH1 Arabidopsis Affymetrix целом массивы генома.

Представитель Результаты

Мы обнаружили значительное количество GFP-положительных клеток в канале GFP по FACS (рис. 2). В анализах оптимизации использования GFP усилитель-ловушки родителей, конститутивно GFP-экспрессирующих линии, J0571, отображается ~ 17% до 24% GFP-положительных протопластов, тогда как линия с сосудистыми и кожными выражения, J1071, был ~ 1,4% GFP-положительных протопластов (табл. 1). Сортировка 3 х 500 мкл (~ 1,5 мл в общей сложности протопластов приостановка) J0571 протопластов в течение 1 ч дали ~ 100000 GFP-положительных протопластов. Сортировка 3 х 500 мкл (~ 1,5 мл полную остановку протопластов) из J1071 протопластов в течение 1,5 ч дали ~ 3000 GFP-положительных протопластов. Конфокальной изображений указано очень высокий выход протопластов как для J0571 и J1071 образцов до сортировка была проведена (рис. 3C и 3E), и отсортированных фракций, содержащихся только яркие GFP-люминесцентные протопластов (рис. 3G и данные не приведены). Это открытие подтверждает, что нетронутые GFP-положительных протопласты могут быть отсортированы по СУИМ. Не-GFP протопластов также можно сортировать и собраны в отдельный канал. Не-GFP протопластов служить идеальным отрицательного контроля для последующего анализа микрочипов для выявления конкретных изменений в экспрессии генов при восстановлении holophytochrome уровнях. РНК извлечения из изолированных протопластов (1 мл) дает РНК в достаточном количестве для обнаружения fluorospectrometry (рис. 4). Изолированные РНК оценивали с помощью NanoDrop инструмента (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) и количественно NanoDrop 3.7.1 программного обеспечения количественной РНК. РНК урожайности предварительно отсортированные C24 дикого типа протопластов или FACS-сортируются, GFP-положительных протопластов усилитель ловушку превысил менее 20 нг необходимые для использования в РНК-маркировки анализов для микрочипов (табл. 2).

Enhancer Ловушка линии	% От GFP-положительных протопластов	Количество отсортированных протопластов GFP
J0571	17,18% ~ 24,06%	26400 ~ 36000
J1071	~ 1,43%	1000 ~ 1300

Таблица 1. Процент GFP-положительных протопластов из двух усилитель ловушку линии до сортировки и количество GFP-положительных протопластов собранные работает 500 мкл суспензии через протопласт флуоресценции Активированный сотовый Сортировщик (FACSVantage, BD).

Завод линии	РНК-выход (нг)
C24 WT	12486,5
J0571	60
J1071	71,5

Таблица 2. Выход из РНК изоляции от протопластов. РНК выделяли из предварительно отсортированные C24 дикого типа или отсортировать GFP-положительных протопластов из двух линий усилитель ловушку и количественно.

Рисунок 1. GAL4 усилитель-ловушки основе индукции биливердин редуктазы (BVR) экспрессии в трансгенных растений Arabidopsis thaliana. (А). Человек, выбранный из библиотеки GAL4 основе усилитель ловушку линий, которые содержат GAL4 проблематику маркерный ген GFP, могут пересекаться со строки, содержащей GAL4 проблематику гена-мишени, чтобы вызвать экспрессию гена-мишени в GAL4 содержащей ячейки, помеченные GFP по флуоресценции. На основе рисунка из д-р Джим Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) производство фитохрома хромофора, phytochromobilin (PΦB) и holophytochrome в родительских линий. (С) Влево, сокращение биливердин IXα (BV IXα) и PΦB по биливердин редуктазы (BVR) деятельности БР и PΦR, соответственно. BVR активности приводит к истощению PΦB и приводит к сокращению производства фотоактивных holophytochrome. Правильно, реакции, катализируемой BVR показано.

Рисунок 2. Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) приобретение участков точка. Сравнение протопластов сортировки клеток для C24 дикого типа (А), J0571 (Б) и J1071 (С). () Приобретение точкой сюжета не-GFP флуоресцентные C24 дикого типа протопластов возбуждаются 488-нм аргонового лазера и используется для определения аутофлюоресценция порога. (B) и (С) участков приобретение точка показать пропорции протопластов, которые являются положительными GFP в ответ на возбуждение 488-нм лазером. R3 сортировки ворота в В и С разграничить GFP-положительных целей, которые были отсортированы по флуоресценции, активированных сотовый Сортировщик (FACSVantage, BD) и собраны. Красный канал указывает гalues ​​для хлорофилла аутофлюоресценция из протопластов и зеленый канал указывает значения для GFP флуоресценции.

Рисунок 3. Конфокальной микроскопии протопластов растений используется для сортировки клеток. Конфокальной лазерной отсканированных изображений протопластов до (А, С, Е) и после (G), сортировка по флуоресценции, активированных сотовый Сортировщик (СУИМ). B, D, F и Н DIC изображений. Протопластов C24 дикого типа (А, В), J1071 (C, D) и J0571 (E, F, G, H) показаны. Изображения С, Е и G были объединены образы GFP флуоресценции (ВР 505 нм - 575 нм) и флуоресценции (LP 650 нм), полученных из возбуждение с 488-нм лазером. Через Н среднем на 4 сканирует под 63x нефти. Bar = 10 мкм.

Рисунок 4. Количественная оценка РНК, выделенной из протопластов по fluorospectrometry. РНК, выделенная из (А) C24 дикого типа, (B), J0571, и (C) J1071. Указывает РНК для предварительно отсортированных дикого типа протопластов. B и C указывают на РНК из GFP-положительных протопластов, упорядоченные по флуоресценции, активированных сортировки клеток (FACS). РНК количественного программного обеспечения, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

Обсуждение

Экспрессия генов профилирования через микрочипы (1) показал, что более 30% генов Arabidopsis сеянцы света регулируется ¹¹ и (2) выявила обширная группа генов, кодирующих светового сигнала трансдукции белков, участвующих в фитохрома сигнальный каскад ^{12, 13} . Такие эксперименты позволя?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BVR antibody	QED Bioscience Inc.	56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10	SERVA Electrophoresis	MSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixture	Sigma-Aldrich	G5768
Macerozyme R-10	SERVA Electrophoresis	PTC 001
MES, low moisture content	Sigma-Aldrich	M3671
Murashige and Skoog salts	Caisson Laboratories	74904
Phytablend	Caisson Laboratories	28302
RNeasy Plant Minikit	Qiagen	16419