에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

요약

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

초록

라이트 mediates 식물의 수명주기 전반에 걸쳐 발달 및 적응 과정의 배열입니다. 식물 활용 흡광 photoreceptors은 감각과 불빛에 적응이라는 분자를. 멀리 빨간 / 빨간색 빛을 흡수 phytochrome photoreceptors 것은 광범위하게 연구되고있다. Phytochromes 그들이 연구되고이있는 모든 높은 식물 시스템에서 확실하고 중복 기능을 가진 단백질의 가족으로 존재

프로토콜

1. 식물의 성장

1. 격리된 확인 UAS - BVR X GAL4 - GFP 향상제 트랩 라인과 같이 ⁴ 설명 (요약에 대한 그림을 참조하십시오. 1) 야생 입력하거나 부모의 라인이 땅에서 sown 있으며, 즉, 한 줄에 ~ 2000 소독 종자.
2. 식물 22 100 μmolm ^-2 S ^-1의 하얀 조명 아래에서 흙 5 주 동안 재배 ° C와 70 % 습도.

2. 리프 원형질 분리 (Denecke 및 비테일 ⁹ 적응)

1. protoplasts를 분리, 텍, 버퍼를 준비합니다. - (N - morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES, 2.56 ㎜), 0.75 g의 염화칼슘 이수화물 (CaCl ₂ 0.2 H ₂ O, 6.75 3.1 g Gamborg의 B5 소금, 0.5 g 2 : 일리터 텍스 버퍼 들어, 다음과 같은 구성 요소를 달다 음), 0.25 g의 질산 암모늄 (NH ₄ NO _3, 3.12 MM)은 136.9 g의 자당 (0.4M)가. deionized, 증류수의 ~ 900 ML (ddH ₂ O)에서 완전히 구성 요소를 디졸브 1과 5.7으로 산도를 가지고 M 코. 1리터와 진공 펌프에 연결된 0.2 μm의 병 - 최고의 필터 소독 필터 최종 볼륨을 가져와.
2. 식물의 녹색 잎이 건강 (느슨하게 비커에 포장 단풍 ~ 250 ML) 수집하고 ~ 40 ML ddH ₂ O 4 배와 린스, 살균 ddH ₂ O.로 두 번 rinsing 다음 얇은 스트립에 # 20 메스, 절단 잎을 사용하고 동일이 50 ML 멸균 플라스틱 튜브로 조직을 나눕니다. 10X 잎 소화 주식 솔루션 (10X 잎 소화 주식 솔루션 5 ML의 나누어지는를 추가하여 1X 잎 소화 혼합물을 준비 : W / V Macerozyme R - 10, 4% W / V 텍 버퍼에 Cellulase "Onozuka"R - 10, 2 % 해산 0.2 μm의 45 ML 신선한 텍스 버퍼)를 -80 ° C에서 5 ML aliquots를 필터링하고 동결로 소독 필터. 모든 잎 조직을 커버 50 ML 튜브 당 1X 잎 소화 믹스의 ~ 25 ML을 추가합니다.
3. 부드러운 떨고있는 로커에 실온에서 3 시간 보육 다음 물을 펌프에 연결된 진공 건조기를 사용하여 실온에서 1 시간 오픈 튜브의 소화 혼합물의 잎 조직에 침투 진공. 1X 잎 소화 믹스의 잎 조직과 덮인 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해이 과정에서 알루미늄 호일에 싸서 보관됩니다.
4. 삼시간 후, protoplasts 발표 ~ 2 분 동안 로커 속도를 향상시킬 수 있습니다. 부스러기를 제거하고 멸균 유리 비커에 여과물를 수집하기 위해 멸균 치즈 천의 두 레이어를 통해 원유 원형질의 현탁액을 필터링합니다. 멸균 페트리 접시에 멸균 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 여과물을 필터링합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 새로운 살균 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 멸균 페트리 접시를 세척하여 표면을 준수하는 어떠한 protoplasts를 수집하는 신선한 텍스 버퍼의 15-20 ML에 대해 사용합니다.
5. 10 100xg에서 스윙 버켓 로터를 사용하여 ° C를 15 분 (가속 6 감속 0)에 대한 통해 흐름을 원심 분리기.
6. ~ 25을 제거 - 잔류 및 pelleted 파편을 포함하는 부동 원형질 층 아래의 액체 30 ML을 부동 원형질 층을 교란하고 ~ 10 떠나지 않고 연동 펌프에 연결된 멸균 9 "유리 파스퇴르 피펫과 함께 - 15 ML 볼륨을.
7. 부드럽게 protoplasts을 resuspending 동안 40 ML의 최종 볼륨에 신선한 텍스 버퍼를 추가합니다.
8. 가능한 많은 세포 파편을 제거하는 단계를 2.5-2.7 두 번 반복합니다. 원심 분리 시간은 첫 번째 반복에서 10 분 및 최종 반복 5 분 줄어 듭니다.
9. 새로운 15 ML 튜브로 절단, 살균 한 ML 전송 피펫과 부동 protoplasts을 대기음. 4에서 2 시간 동안을 정렬하거나 어둠 속에 저장 ° C를 정렬까지 직접 진행합니다.

3. 형광 - 활성 셀 정렬 (외과)에서 원형질의 정렬

1. 정렬하기 전에, 원형질 무결성 및 원형질의 수영장에서 GFP 형광의 존재를 확인하기 위해 여기에 488 - nm의 레이저를 사용하여 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 의해 protoplasts을 확인합니다. 최소한의 파편 외과 정렬 노즐을 막히는 것을 방지하는 것이 필요합니다.
2. 적응 프로토콜 ^10을 다음과 주위에 9 PSI의 시스템 압력과 6,000 달러와 15000 사이의 행사 가격에서 매크로 정렬 머리에 200 μm의 노즐을 사용하여 외과 통해 텍 버퍼 (BD FACSVantage SE, BD Biosciences)에 정렬 고립 protoplasts.
3. 야생 형이 아닌 GFP의 protoplasts은 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용됩니다.
4. GFP 양성 protoplasts, 30분의 530 밴드를 사용하여 GFP 형광을 확인하기 위해 488 - NM 아르곤 라인에 공기 냉각 아르곤 레이저 (스펙트럼 물리 모델 177, 뉴 포트 주식 회사, 어바인, CA) 100 MW에서 운영을 사용하여 정렬 세포를 수집하는 필터를 전달합니다.
5. GFP 양성 protoplasts의 수집에 따라, 단계 3.1 상세으로 CLSM으로 정렬 protoplasts을 확인합니다.
6. Qiagen RNeasy 플랜트 미니 키트를 사용하여 정렬 protoplasts에서 총 RNA를 추출합니다. Affymetrix GeneChip Expr에서 설명한대로 cDNA가 다음 하이브 리다이 제이션 준비할 수ession 분석 기술 매뉴얼 후 AtH1 Arabidopsis Affymetrix 전체 게놈 배열에 hybridized.

대표 결과

우리는 외과 (그림 2)에 의해 GFP의 채널에 GFP 양성 세포의 상당수를 발견했습니다. 혈관과 피부 표현과 선, J1071은 ~ 1.4 %의 GFP 양성 protoplasts 있었 반면, GFP 향상제 - 트랩 부모, constitutively GFP - 표현 라인, J0571, 표시 ~ 17 %로 24% GFP 양성 protoplasts를 사용하여 최적화 assays에서 (표 1). 1 H에 대한 J0571 protoplasts 3 X 500 μl (원형질의 정지 ~ 1.5 ML 합계)의 정렬하면 ~ 100,000 GFP 양성 protoplasts했다. 1.5 H에 대한 J1071 protoplasts 3 X 500 μl (~ 1.5 ML 총 원형질 서스펜션)의 정렬하면 ~ 3000 GFP 양성 protoplasts했다. 분류가 (그림 3C 및 3E) 실시되기 전에 공촛점 이미지 J0571 및 J1071 모두 샘플 protoplasts 매우 높은 수율을 표시하고 정렬 분수는 밝은 GFP - 형광 protoplasts를 (그림 3G 및 표시되지 데이터)가 들어 있습니다. 이 발견은 그대로 GFP 양성 protoplasts가 외과로 정렬할 수 있습니다 확인합니다. 비 GFP의 protoplasts 또한 정렬 및 별도의 채널에 수집하실 수 있습니다. 비 GFP의 protoplasts은 holophytochrome 수준의 감소에 따라 유전자 발현의 구체적인 변화를 감지하기 위해 후속 microarray 분석을위한 이상적인 부정적인 제어 역할을합니다. 격리 protoplasts (1 ML) fluorospectrometry (그림 4)에 의해 검출을위한 충분한 수량의 산출의 RNA에서 RNA 추출. 절연 RNA는 NanoDrop 악기 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽)을 사용하여 평가하고 NanoDrop 3.7.1 RNA의 부량 소프트웨어 계량했다. 에서 RNA의 수확량은 C24 야생 형 protoplasts 또는 외과 - 정렬 GFP 양성 향상제 트랩 protoplasts가 사용하기 위해 필요한 최소 20 NG를 초과를 미리 정렬 RNA - 라벨 microarray (표 2) assays합니다.

향상제 트랩 린	GFP 양성 protoplasts의 비율 (%)	정렬 GFP의 protoplasts 수
J0571	17.18 % ~ 24.06 %	26,400 ~ 36,000
J1071	~ 1.43 %	1,000 ~ 1,300

정렬 및 형광 활성 세포 분류기 (FACSVantage, BD)를 통해 원형질 서스펜션 500 μL를 실행하여 수집한 GFP 양성 protoplasts의 수를 전에 두 향상제 트랩 라인에서 GFP 양성 protoplasts 표 1. 비율.

플랜트 라인	RNA 수율 (NG)
C24 WT	12486.5
J0571	60
J1071	71.5

표 2. protoplasts에서 RNA 격리에서 항복. RNA는 두 향상제 트랩 라인에서 미리 정렬 C24 야생 입력하거나 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 분리 계량되었습니다.

그림 1. 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) 유전자 변형 Arabidopsis thaliana 공장에서 표현의 GAL4 향상제 - 트랩 기반 유도. (A). GAL4 - 응답 GFP 마커 유전자를 포함하는 GAL4 기반 향상제 트랩 라인의 라이브러리에서 선택한 개인은에서 대상 유전자의 표현을 유도하는 GAL4 - 응답 대상 유전자를 포함하는 라인 GAL4 함유 표시 전지와 교차 수 있습니다 GFP 형광에 의해. 박사 짐 Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html)에서 수치를 기반으로. 상위 라인에 phytochrome 발색단, phytochromobilin (PΦB)와 holophytochrome의 (B) 제작. (C) 왼쪽, 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) BR 및 PΦR하는 활동에 의해 빌리베르딘 IXα (BV IXα)와 PΦB 감소, 각각. BVR 활동 PΦB의 고갈에 결과 및 광활성이있는 생산의 감소로 연결이 holophytochrome. 맞아요, BVR에 의해 촉매 반응이 나타납니다.

그림 2. 형광 활성 세포 정렬 (외과) 수집 도트 플롯. 원형질 세포의 비교 C24 야생 유형 (A), J0571 (B) 및 J1071 (C)에 대한 정렬. 488 - nm의 아르곤 레이저에 의해 흥분하고 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용 이외의 GFP 형광 C24 야생 타입 protoplasts의 (A) 취득 도트 플롯. (B)와 (C) 수집 도트 플롯은 488 - NM 레이저에 의해 여기에 대응 긍정적인 GFP 아르 protoplasts의 비율을 보여줍니다. B와 C 구분 형광 활성화된 세포 분류기 기준으로 정렬 (FACSVantage, BD)와 수집된 GFP 양성 목표에 R3 정렬 게이츠. 레드 채널 V를 나타냅니다protoplasts과 녹색 채널에서 엽록소의 autofluorescence에 대한 alues​​는 GFP 형광 값을 나타냅니다.

그림 3. 셀 정렬에 사용되는 식물 protoplasts의 공촛점 현미경. 공촛점 레이저 형광 활성화된 세포 분류기 (외과)를 통해 (G) 정렬하기 전에 (A, C, E) 후 protoplasts의 이미지를 스캔. B, D, F와 H는 DIC 이미지입니다. C24 야생 유형 (A, B), J1071 (C, D)와 J0571 (E, F, G, H)의 Protoplasts가 표시됩니다. 와 488 - nm의 레이저로 여기에서 얻은 Autofluorescence (LP 650 NM) - 이미지 C, E와 G는 GFP 형광 (575 nm의 BP 505 NM)의 이미지를 통합하고 있습니다. H를 통해 A는 63x 오일 이하 4 스캔의 평균입니다. 바 = 10 μm의.

그림 4. fluorospectrometry로 protoplasts으로부터 격리 RNA의 양을 정함. RNA는 (A) C24 야생 유형 (B) J0571, 그리고 (C) J1071에서 추출한. 사전 정렬 야생 형 protoplasts에 대한 RNA를 나타냅니다. B와 C는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)를 기준으로 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 RNA를 나타냅니다. RNA의 부량 소프트웨어 NanoDrop 3.7.1 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽).

토론

microarrays를 통해 유전자 발현 프로 파일링 (1) Arabidopsis 모종의 유전자의 30 % 이상이 가벼운 규제 ^11아르 것을 지적하고 있으며 (2) phytochrome 신호 폭포 ^{12, 13에} 관련된 빛 신호 전달 단백질을 인코딩 유전자의 거대한 그룹을 확인했습니다 . 이러한 실험은 빛이 유전자 발현에 신속하고 장기적인 변화를 유도하는 것이 좋습니다. phytochromes 각 수영장 발달과 적응 반응의 하위 집합만를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BVR antibody	QED Bioscience Inc.	56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10	SERVA Electrophoresis	MSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixture	Sigma-Aldrich	G5768
Macerozyme R-10	SERVA Electrophoresis	PTC 001
MES, low moisture content	Sigma-Aldrich	M3671
Murashige and Skoog salts	Caisson Laboratories	74904
Phytablend	Caisson Laboratories	28302
RNeasy Plant Minikit	Qiagen	16419