A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يوصف إجراء بسيط من vibratome sectioning الجهاز كورتي ، تليها المجهري ومبائر المناعية. يسمح هذا الإجراء للحفاظ على تحسن من التهندس الخلوي غرامة الجهاز الثدييات كورتي ، ويسمح بالتالي لتقدير دقيق لأنواع الخلايا.
الجهاز الثدييات كورتي هو أمر غاية الخلوية فسيفساء من الشعر mechanosensory nonsensory والخلايا المساندة
(إعادة النظر في 1،2). التصور من هذه الفسيفساء الخلوية وغالبا ما يتطلب أن جهاز كورتي هو عبر مقطوع. على وجه الخصوص ، يمكن للعمود nonsensory دايترس والخلايا '، التي تقع النواة basally فيما يتعلق خلايا الشعر ، لا يمكن تصور دون sectioning عبر جهاز كورتي. ومع ذلك ، فإن التهندس الخلوي الحساسة للجهاز كورتي الثدييات ، بما في ذلك العمليات السيتوبلازمية الدقيقة للعمود والخلايا دايترس '، من الصعب الحفاظ على النسيجية من خلال إجراءات روتينية مثل البارافين والبرد sectioning ، والتي تتوافق مع معيار تقنيات تلطيخ المناعى.
هنا أصف إجراء بسيط وقوي يتألف من vibratome sectioning من القوقعة ، وتلطيخ المناعى من هذه المقاطع vibratome في جبل بأكمله ، تليها المجهري متحد البؤر. وقد استخدم هذا الإجراء على نطاق واسع لتحليل immunhistochemical أجهزة متعددة ، بما في ذلك الماوس برعم الطرف ، الزرد الأمعاء والكبد والبنكرياس ، والقلب (انظر 3-6 لأمثلة مختارة). بالإضافة إلى ذلك ، كان هذا الإجراء سوسسفول] لكل من التصوير وquantitificaton من عدد الخلايا في العمود أجهزة متحولة والتحكم في كورتي في كل من الأجنة والبالغين 7 الفئران. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، لا يستخدم حاليا على نطاق واسع لفحص الجهاز من الثدييات كورتي. يوصف المحتملة لهذا الإجراء لتوفير الحفاظ على حد سواء المعزز للالتهندس الخلوي غرامة الجهاز الكبار كورتي ، والسماح للالكمي لمختلف أنواع الخلايا.
1. العزلة والتثبيت الداخلي للآذان
2. قطع المقاطع vibratome
3. أقسام الضد تلطيخ vibratome
المضي قدما في الأضداد وصمة عار. المقاطع في جبل لعملية برمتها ، التعويم الحر في الحل. وفيما يلي تلوين الأجسام المضادة للبروتوكول سبيل المثال علامة S100 من خلايا عمود الجهاز كورتي ، ولكن يمكن استخدام أي بروتوكول للجسم. وتجرى جميع يغسل في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.
4. تصاعد المقاطع على الشرائح المجهرية ومبائر
لمنع تكسير أبواب سميكة مع ساترة ، وعندما تصاعد المقاطع الفردية ، لا بد من إدراج فاصل بين شريحة المجهر وساترة ل. وأدناه طريقتين بديلة لتركيب أبواب سميكة vibratome :
5. ممثل النتائج :
A - Z مبائر ممثل كومة من خلال القسم vibratome ملون للبروتين S100 ، التي هي موجودة في عمود والخلايا دايترس ، وcounterstained مع صبغة نووية (الشكل 3A - F). كل لوحة هي صورة مبائر التي اتخذت في 3 ميكرومتر الخطوات ، مع لوحة وصورة مبائر الحصول على أقرب إلى السطح من المقطع vibratome ولوحة F صورة مبائر الحصول على معظم داخليا داخل القسم vibratome. يظهر الحد الأدنى من تعطل الجهاز مورفولوجية كورتي. على وجه الخصوص ، ليست مقطوعة ملحقات هيولي من خلايا العمود. بالإشارة إلى ظهور واختفاء نوى الخلايا من خلال عمود ض المكدس (الشكل 3A إلى 3F) ، يمكن عدها سواء خلية عمود الداخلي والخارجي رقم (انظر الترقيم ، والشكل 3A -- واو). نظرا لعدد صغير من كل نوع من الخلايا في صورة مبائر ، يمكن استخدام هذا الأسلوب لحساب معظم أنواع الخلايا في جهاز كورتي.
الشكل 1. سليمة ، والمغطى آذان الداخلية البالغين 15 أسبوعا من العمر ، في كبسولة أذني. (A) المغطى الكبسولة أذني اليمنى (بين قوسين) في الجمجمة ، وينظر إليها من وجهة نظر من داخل الرأس ، وبعد إزالة المخ. الأمامي إلى يمين. (ب) سليمة ، ومدتها 15 أسبوعا من العمر بعد تشريح الأذن الداخلية من الجمجمة. السطح الوحشي للالأذن الداخلية اليسار مرئيا ؛ السطح الإنسي من الأذن الداخلية الحق مرئيا. تسميات تشير إلى مواقع القناة شبه الدائرية الأمامي (ASC) ، وشارك (القوقعة) ، وآه (النافذة البيضوية).
الشكل 2 : (أ) الأذن الداخلية من الجامعة البالغين 15 أسبوعا من العمر ، جزءا لا يتجزأ من agarose في وسط قالب التقشير بعيدا. يشار الطائرة المقصود من المقطع. (ب) عن قرب صورة الأذن 15 أسبوعا من العمر ، كلها داخلية قبل التضمين. وقد تم تشريح جزء من العظام المحيطة بها بعيدا حتى التيه الغشائي يمكن أن ينظر إليها أكثر وضوحا. وتتبع الجانبي نصف دائري قناة (LSC) ، الأمامي شبه دائرية قناة (ASC) ، والقوقعة (شارك) (منحنيات بيضاء). وأشار بدوره القاعدية من القوقعة (رأس السهم) وطائرة المقصود من القسم (خط متقطع). (C) الممثل كروسS - القسم من خلال القوقعة. في مقطع واحد ، عبر من خلال قناة القوقعية ، الجهاز كورتي (درجة مئوية) هو محاصر ، وعائي السطر (اس) هو بين قوسين ، ويشار غشاء رايسنر (روم).
الشكل 3 ، وجهاز كورتي في الماوس من النوع البري في P21. (AF) سلسلة متعاقبة مبائر ، في خطوة الخلايا 3 ميكرومتر الحجم ، عن طريق جهاز الأضداد الملطخة S100 كورتي لتصور خلايا عمود ودايترس. يتم ترقيم بحساب الخلايا عمود الداخلي والخارجي من البداية إلى نهاية السلسلة. الاختصارات : IHC (الخلايا الداخلية الشعر) ، aIHC (الخلية المجاورة الشعر الداخلي) ، OHC (الخلية الخارجي الشعر) ، PC (خلية عمود) ، DC (خلية دايترس ').
إجراءات sectioning vibratome ، تليها التصوير المناعية ومبائر يسمح التصور من جهاز كورتي مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة. بوضوح ، وصور مأخوذة من مبائر المناطق الداخلية في المقطع vibratome تظهر الحفاظ ممتازة من التشكل الخلوية التي يقتصر فقط التحف التثبيت. صور مبائر المتخذة على مقربة م?...
فإن الكاتب يعترف أن استخدام الأطفال الأساسية للأبحاث معهد التصوير المجهري مبائر والدكتور تشانغ جيان لاقتراح تحميل المقاطع باستخدام الخرز agarose. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DC010387.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
---|---|---|---|
ايكا VT1000S بالاهتزاز بليد مشراح | لايكا | ||
LSM510 زايس مجهر المسح بالليزر مبائر | زايس | ||
طالب دومون # 5 الملقط | أدوات العلوم غرامة | 91150-20 | |
عالى النقاء قليلة نقطة الانصهار Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
قشر - A - طريق تضمين القالب | Polysciences | 18986 أو 18646A | |
ألبومين المصل البقري | جاكسون ImmunoResearch | 001-000-162 | |
مصل الماعز | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | داكو | Z0311 | |
الكسا فلور 568 الماعز المضادة للأرنب مفتش | Invitrogen | A - 11036 | 1:1000 تخفيف |
Vectashield | ناقلات مختبرات | H - 1000 | |
YO - PRO - 1 | Invitrogen | Y3603 | |
فراغ الشحوم | الصياد | S41718 | |
افى جل جل الأزرق | الحيوي راد | 153-7301 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved