Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Method Article
Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.
Das Säugetier-Corti-Organ ist ein hoch geordneter zellulären Mosaik mechanosensorischen Haar und nichtsinnlichen Stützzellen
(Besprochen in 1,2). Visualisierung von diesem zellulären Mosaik oft verlangt, dass das Corti-Organ im Querschnitt ist. Insbesondere kann die nichtsinnlichen Säule und Deiters 'Zellen, deren Kerne sind basal in Bezug auf die Haarzellen befinden, nicht sichtbar gemacht werden, ohne Querschliffe Corti-Organ. Allerdings ist die zarte Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, einschließlich der feinen zytoplasmatischen Prozesse der Säule und Deiters 'Zellen, schwer durch routinemäßige histologische Verfahren wie Paraffin und Kryo-Schnitte, die kompatibel mit Standard-immunhistochemische Färbetechniken sind zu bewahren.
Hier beschreibe ich eine einfache und robuste Verfahren, bestehend aus Vibratom Schnitte der Cochlea, immunhistochemische Färbung dieser Vibratom Abschnitte in whole mount, durch konfokale Mikroskopie verfolgt. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die immunhistochemische Analyse von mehreren Organen, einschließlich der Maus Gliedmaßenknospe, Zebrafisch Darm, Leber, Bauchspeicheldrüse und Herz (siehe 3-6 für ausgewählte Beispiele) verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren erfolgreiche sowohl für Imaging und quantitificaton der Säule Zellzahl in der Mutante und Kontrollorgane von Corti in beiden Embryonen und erwachsenen Mäusen 7. Diese Methode ist jedoch derzeit nicht weit verbreitet, um die Säugetier-Corti-Organ zu untersuchen. Das Potenzial für dieses Verfahren, um beide bieten verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der erwachsenen Corti-Organ und erlauben die Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen beschrieben.
1. Isolation und Fixierung der inneren Ohren
2. Cutting Vibratom Abschnitte
3. Antikörper-Färbung Vibratom Abschnitte
Fahren Sie mit dem Antikörper-Färbung. Prozess Abschnitte ganz-mount, frei schwebend in Lösung. Unten ist ein Beispiel Antikörper-Färbung Protokoll für den S100 Marker der Säule Zellen des Corti-Organ, sondern kann das Protokoll für jeden Antikörper verwendet werden. Alle Wäschen sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt.
4. Montage Abschnitte über Rutschen und konfokale Mikroskopie
Um zu verhindern, Zerkleinern der dicke Abschnitte mit dem Deckglas, bei der Montage einzelner Abschnitte, muss ein Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas eingefügt werden. Unten sind zwei alternative Methoden der Montage dicken Vibratom Abschnitte:
5. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Vertreter der konfokalen Z-Stapel durch eine Vibratom Abschnitt für S100-Protein, das in Säule und Deiters 'Zellen und gegengefärbt mit einem nuklearen Farbstoff (Abb. 3A-F) gefärbt. Jedes Panel ist die konfokale Abbildung bei 3 um-Schritte, mit Panel A die konfokale Abbildung erhalten am nächsten an der Oberfläche des Vibratom Abschnitt und Panel-F die konfokale Abbildung meisten intern in der Vibratom Abschnitt erhalten. Die Morphologie der Corti-Organ scheint minimal gestört. Insbesondere sind die cytoplasmatische Erweiterungen der Säule Zellen nicht gebrochen. Indem man das Auftauchen und Verschwinden der Säule Zellkernen durch die z-Stapel (Abb. 3A bis 3F), können sowohl innere und äußere Säule Zellzahl gezählt (siehe Nummerierung, 3A. - F) sein. Aufgrund der geringen Anzahl von jedem Zelltyp pro konfokale Abbildung, kann dieser Ansatz verwendet, um den meisten Zelltypen innerhalb des Corti-Organ zu zählen.
Abbildung 1. Intakt, 15-Wochen alten, eingehüllt erwachsene Innenohr in der Labyrinthkapsel. (A) Das Recht Ohrkapsel (in Klammern) eingeschlossen in den Schädel, betrachtet von einem Aussichtspunkt im Kopf, nach der Entfernung des Gehirns. Anterior ist auf der rechten Seite. (B) Intact, 15-Wochen alten Innenohr nach der Sektion aus dem Schädel. Seitliche Fläche des linken Innenohr ist sichtbar; medialen Fläche des rechten Innenohr sichtbar ist. Labels zeigen die Positionen der vorderen halbkreisförmigen Kanal (asc), Co (Cochlea) und ow (ovales Fenster).
Abbildung 2. (A) insgesamt Innenohr von einem 15-Wochen alten Erwachsenen, in Agarose in der Mitte einer Peel-Away Form eingebettet. Beabsichtigte Schnittebene angezeigt. (B) Close-up Bild von einem 15-Wochen alten, ganze Innenohr vor dem Einbetten. Ein Teil der umgebenden Knochen wurde entfernt, so dass die häutige Labyrinth eines betrachteten könnte deutlicher seziert. Die seitlichen halbkreisförmigen Kanal (LSC), anterior halbkreisförmigen Kanal (asc) und Cochlea (co) sind zurückzuführen (weiß Kurven). Die basalen Windung der Cochlea (Pfeilspitze) und bestimmt Schnittebene (gestrichelte Linie) angegeben sind. (C) Repräsentative cross-Schnitt durch die Cochlea. In einem Querschnitt durch den Ductus cochlearis, das Corti-Organ (oC) boxed ist, ist die Stria vascularis (sv) Klammern und die Reissner-Membran (Rm) angezeigt wird.
Abbildung 3. Das Corti-Organ in einem Wildtyp-Maus auf P21. (AF) Sequential konfokalen Serie, in einem 3 um Schritt-Größe, durch eine S100-Antikörper-gefärbten Corti-Organ an der Säule Zellen und Deiters visualisieren 'Zellen. Grafen von inneren und äußeren Säulen Zellen von Anfang bis zum Ende der Serie sind nummeriert. Abkürzungen: IHC (inneren Haarzelle), AIHC (benachbarten inneren Haarzellen), OHC (äußere Haarzellen), PC (Säule Zelle), DC (Deiters 'Zelle).
Das Verfahren der Vibratom Schnitte, durch Immunhistochemie und konfokale Bildgebung gefolgt ermöglicht die Visualisierung des Corti-Organ mit minimalen Gewebeschäden. Offensichtlich zeigen konfokale Bilder aus dem internen Regionen in der Vibratom Abschnitt entnommen ausgezeichnete Erhaltung der Zellmorphologie, die nur durch Fixierung Artefakte begrenzt ist. Konfokale Bilder der Nähe der beiden cut-Oberflächen eines Vibratom Abschnitt entnommen werden oft von den Bildern aus dem internen Regionen zu unterscheiden,...
Der Autor möchte die Nutzung der Kinder-Forschungsinstitut Imaging Core für die konfokale Mikroskopie und Dr. Jian Zhang für den Vorschlag bestätigen die Abschnitte mit Agaroseperlen montieren. Diese Arbeit wurde vom NIH DC010387 finanziert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
---|---|---|---|
Leica VT1000S vibrierender Klinge Mikrotom | Leica | ||
Zeiss LSM510 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop | Zeiss | ||
Studentische Dumont Nr. 5 Pinzetten | Feine Science Tools | 91150-20 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Peel-A-Way Einbettform | Polysciences | 18986 oder 18646A | |
Rinderserumalbumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
Ziegenserum | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
Alexa Fluor 568 Ziege anti-Kaninchen IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000-Verdünnung |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
Vakuumfett | Fischer | S41718 | |
Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten