Vibratome на разделы для работы с улучшенными Сохранение Cytoarchitecture из млекопитающих орган Корти

Резюме

Простая процедура vibratome срезов органа Корти, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии описана. Эта процедура позволяет для улучшения сохранения тонкой cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, и, следовательно, обеспечивает точную количественную оценку типов клеток.

Аннотация

Млекопитающих кортиева органа высокоупорядоченных сотовой мозаику mechanosensory волосы и nonsensory поддерживающие клетки
(Обзор в ^1,2). Визуализация этой клеточной мозаики часто требует, чтобы орган Корти является кросс-секционного. В частности, nonsensory столп и клетки Дейтерса, ядра которых расположены при основании в отношении волосковых клеток, не могут быть визуализированы без перекрестного секционирования кортиева органа. Тем не менее, тонкое cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, в том числе тонких цитоплазматических процессов столп и клетки Дейтерса, трудно сохранить обычными гистологическими процедуры, такие как парафин и крио-срезов, которые совместимы со стандартными методами иммуногистохимического окрашивания.

Здесь я опишу простой и надежной процедуру, состоящую из vibratome секционирования улитки, иммуногистохимического окрашивания vibratome секций в целом гору, а затем с помощью конфокальной микроскопии. Эта процедура широко используется для immunhistochemical анализ многих органов, включая почки мыши конечностей, данио кишечника, печени, поджелудочной железы и сердца (см. ^3-6 для отдельных примерах). Кроме того, эта процедура была успешен как для обработки изображений и quantitificaton столба номер ячейки в мутанта и контроля органов Корти в обоих эмбрионов и взрослых мышей ^7. Этот метод, однако, в настоящее время широко не используется, чтобы исследовать млекопитающих орган Корти. Потенциал для этой процедуры как обеспечить повышенную сохранность тонкой cytoarchitecture из взрослых орган Корти и позволяют количественно оценить различные типы клеток описано.

протокол

1. Выделение и фиксация внутреннего уха

1. Для анализа клеточных паттернов в органе Корти, эвтаназии надлежащим поставил эмбрионов или взрослых.
2. Рассеките из слуховой капсулы, содержащие мембранных внутреннего уха. В мыши, это можно легко сделать на эмбрионах на эмбриональной (E) день 14,5 лет и старше, в котором E0.5 это день, при которой влагалищный плагин обнаружено не было. Препарирование слуховой капсулы осуществляется первым путем обезглавливания и открытие черепа в средней линии. Удалить мозга подвергать каждое ухо (рис. 1А). Внутренний слух может быть выложил нетронутыми использованием щипцов (таких, как Дюмон # 5, рис. 1В). Если изображение органа Корти, тщательное удаление всех нейронов и соединительной ткани связано с слуховой капсулы не надо.
3. Fix целом внутреннего уха путем погружения в 4% параформальдегида (PFA) с нежным качалке при температуре 4 ° С в течение ночи в 1,8 мл винт крышками Nunc Cryo-трубки флаконах или других соответствующего размера контейнера. PFA решение должно быть свежо в DDH ₂ 0, затем хранится при температуре -20 ° C до необходимости.
4. На следующий день промыть фиксатором с тремя изменениями 1X фосфатным буферным раствором (PBS). Ткань может храниться в стерильных 1X PBS в течение нескольких дней до месяца, пока готовы к обработке. Для взрослых тканей, известковые отложения в 10% ЭДТА (0,27 М) при 4 ° С в течение 5 дней, с последующей промывкой и хранение в 1X PBS.

2. Резка vibratome разделы

1. Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы в 1X PBS. Добавить низкой температурой плавления агарозы в 1X PBS и СВЧ до агарозном находится в растворе. Позаботьтесь о том, что решение не пузырь за - берут из микроволновой печи периодического и водоворот перемешать. Хранить раствор в 55 ° С водяной бане до готовности к использованию.
2. Использование щипцов, удалить внутреннее ухо от 1X PBS решения и позиции в нижней части Пил-A-Way вложение плесени. Внесите прочь лишний 1X PBS от плесени. Заполните форму, чтобы покрыть ткань с большим количеством жидкости 4% низкой температурой плавления агарозы (рис. 2).
3. Позиция внутреннего уха для секционирования в соответствующей плоскости. Я получил хороший сечения органа Корти путем аппроксимации положение слуховой капсулы как если бы она была оставлена ​​на месте в голове и секционирования в поперечной плоскости. Для E14.5 эмбрионов для взрослых, должность внутреннего уха, так что на него смотрят с боков, с боковых полукруглых канала видны (рис. 2б). Угол внутреннего уха, так что линию, образованную задней стороне слуховой капсулы находится приблизительно на 45-градусный угол от намеченной плоскости срезов (рис. 2а, б). Когда слуховой капсулы рассматривается так, что спинной части слуховой капсулы находится на самом верху, базальный оборот улитки должны быть расположены в нижней части (стрелки на рис. 2B) и передней полукруглые канала (по возрастанию) должны быть в верхней части (рис. 2б).
4. Агарозном установит при комнатной температуре в течение 30 минут. Передача Пил-Away формы, содержащий встроенные ткани до 4 ° С до готовности разделе. Если секционирования будет откладывать на следующий день, добавить 1X PBS, чтобы покрыть агарозы в пресс-форме и хранить в коробке, содержащей влажные бумажные полотенца пропитанные 1X PBS.
5. Пил от пластиковых форм. Использование лезвие бритвы, вырезать окно агарозном содержащих внутренние ткани уха. Позаботьтесь, чтобы плоскость раздела прямая и параллельно противоположной стороне блока, который будет поверхность, на которой блок агарозном приклеивается вниз. С агарозном не проникают в ткани, не обрезать слишком много агарозы из разных тканей, так что ткань будет хорошо поддерживается.
6. Используйте суперклей прикрепить блок к режущей поверхности.
7. Раздел от 40 до 100 мкм толщины vibratome. Сохранить секций в ткани культуры блюдо заполнено 1X PBS, 0,1% TritonX-100. Представитель разрез кохлеарной спираль показана на рис. 2C.
8. Используйте пинцет, чтобы рассекать от агарозы из ткани. Агарозном не проникают в ткани, но будет просто прилипла к наружной поверхности внутреннего уха.
9. При желании, бассейн агарозном-свободной, секционные ткани с помощью пипетки с большими отверстиями открытия, чтобы предотвратить чрезмерное стрижка ткани. При выполнении нескольких пятен антител на нескольких различных тканей, разделы могут быть организованы в 16 - или 24-и культуре ткани блюдо.

3. Антитела разделы окрашивания vibratome

Продолжайте антител пятно. Процесс секций в целом монтажа, свободно плавающих в растворе. Ниже приведен пример окрашивание антител протокол для маркера S100 столба клетки кортиева органа, но протокол может быть использован для любых антител. Все моет проводятся при комнатной температуре, если не указано иное.

1. В нескольких хорошо блюдо культуры ткани, инкубировать в свободном обращении участков с нежным покачиваясь в PBT (1X PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Тритон Х-100) в течение 30 минут.
2. Внесите старые решения и блокируют свободные-ФЗплавающей участки с нежной покачиваясь в PBT + нормальной козьей сыворотки (50 мкл NGS / 1 мл PBT) в течение 30 минут.
3. Внесите старые решения и добавить первичные антитела разводят в PBT + NGS (1:200 разведение S100 в PBT + NGS). Выдержите в течение ночи при 4 ° С с нежным качалки.
4. Внесите от первичного решение антител. Вымойте 3X, 5 мин. с PBT, то 4X, 30 мин. с PBT.
5. Блок с PBT + NGS, 30 мин.
6. Инкубируйте с флуоресцентно-сопряженных вторичные антитела (повышен в козла) разводят в PBT + NGS. Выдержите в течение ночи при 4 ° С, или несколько часов, РТ, нежный качания.
7. Внесите от вторичных решение антител. Вымойте 3X, 5 мин., То 4X, 30 мин. с PBT.
8. Внесите на прошлой PBT мыть и замените соответствующий водный монтажа среде, содержащей ядерные контрастирующая.

4. Монтаж разделы на слайдах и конфокальной микроскопии

Для предотвращения дробления толстых секций с покровным, при монтаже отдельных секций, прокладка должна быть вставлена ​​между слайд микроскопа и покровное. Ниже приведены две альтернативные методы монтажа секций толщиной vibratome:

1. 1. Spacer могут быть созданы путем размещения края вакуумной смазки в квадрат вокруг срез ткани. Таким образом, при прокладке вниз покровное, по краям покровного будут запечатаны с вакуумной смазкой. Надавите на края покровного большим пальцем, чтобы твердо придерживаться его на слайде. Если вакуумной смазки аккуратно и равномерно настоящее время около всех краев покровного, слайд будут запечатаны достаточно для использования на перевернутую конфокальной микроскопии.
   2. Кроме того, прокладку можно создать с помощью хроматографии агарозном смолы известных размер ячейки (например, Аффи-гель синий гель, Bio-Rad). Внесите 1 мкл смолы на предметное стекло в каждом из четырех углов, где покровное будет размещен. Внесите один срез ткани и монтаж средств массовой информации в середине четыре точки смолы. Покровное. При использовании перевернутой конфокальной микроскопии, печать на покровное стекло микроскопа использованием nailpolish.
2. Получить оптические участки окрашенных ломтиками vibratome помощью конфокальной микроскопии. Для количественной оценки различных типов клеток в органе Корти, получить Z-Stack на определенный размер шага (от 1,5 до 3 мкм). Разделы должны быть контр-окрашивали ядерным красителем (шаг 3.8). Изображения могут быть рассмотрены на любом экране компьютера после конфокальной коллекции изображений. Клетки можно пересчитать вручную, путем наблюдения появления и исчезновения ядер в виде изображений, рассматриваются последовательно через Z-Stack.

5. Представитель Результаты:

Представитель конфокальной Z-Stack через vibratome разделе, витражи для S100 белка, который присутствует в столб и клетки Дейтерса, и контрастно с ядерным красителя (рис. 3А-F). Каждая панель конфокальной изображения, принятые на 3 мкм-шаги, с панелью конфокальной изображение, полученное ближе всего к поверхности vibratome раздел и панель F конфокальной изображение, полученное в наиболее внутренне vibratome разделе. Морфологии органа Корти представляется минимально нарушается. В частности, цитоплазматические расширения столб клетки не нарушена. Отмечая появление и исчезновение столб клеточных ядер через Z-Stack (рис. 3А до 3F), внутренних и внешних количество столб ячейки можно пересчитать (см. нумерацию, рис 3A -. F). Из-за небольшого числа каждого типа клеток в конфокальной изображения, этот подход может быть использована для подсчета большинство типов клеток в органе Корти.

Рисунок 1. Неповрежденными, с 15-недельного возраста, взрослые внутреннего уха, заключенная в слуховой капсулы. (А) правой слуховой капсулы (в квадратных скобках), заключенная в черепе, рассматривать с точки зрения внутренней голове, после удаления мозга. Передняя находится справа. (B) неповрежденными, 15-недельных внутреннего уха после вскрытия из черепа. Боковая поверхность левого внутреннего уха является видимым; медиальной поверхности правого внутреннего уха видна. Этикетки указывают расположение передней полукруглые канала (по возрастанию), со (улитки), и вл (овальное окно).

Рисунок 2. () Всего внутреннего уха из 15-недельных взрослых, встроенные в агарозном в центре Пил-Away плесени. Предназначен плоскости раздел обозначается. (B) крупным планом изображение 15-недельного возраста, всего внутреннего уха до вложение. Часть окружающей кости был расчлененный далеко так перепончатый лабиринт может рассматриваться более четко. Боковых полукруглых каналов (LSC), передняя полукруглые канала (по возрастанию), а также улитки (со) прослеживаются (белые линии). Базальный оборот улитки (стрелки) и предназначенная плоскости сечения (пунктирная линия) указаны. (C) представитель КИОS-сечение улитки. В одном разрез улиткового канала, орган Корти (° С) является коробках, полоски сосудистой (SV) в скобки, и мембрана Рейснера (Rm) указывается.

Рисунок 3. Кортиева в дикого типа мышь на P21. (AF) Последовательная конфокальной серии, в 3 мкм, размер шага, через S100 антитела окрашивали орган Корти для визуализации клеток и столп Дейтерса клеток. Графы внутренней и внешней столб клетки от начала и до конца серии пронумерованы. Сокращения: IHC (внутренней клеточной волос), aIHC (смежных внутренней клеточной волос), OHC (внешний волосковых клеток), ПК (блок клеток), DC (клетка Дейтерса »).

Обсуждение

Процедура vibratome секционирования, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии позволяет визуализацию органа Корти с минимальным повреждением тканей. Очевидно, конфокальной снимки, сделанные из внутренних районов в vibratome разделе показывают отличные сохранение клеточной морфо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Leica VT1000S вибрационный Клинок Микротом	Leica
Zeiss LSM510 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии	Zeiss
Студенческая Дюмон # 5 Пинцет	Инструменты изобразительных наук	91150-20
Сверхчистых низкой температурой плавления агарозы	Invitrogen	16520-050
Пил-A-Way вложение плесень	Polysciences	18986 или 18646A
бычьего сывороточного альбумина	Джексон ImmunoResearch	001-000-162
Коза сыворотки	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 козьего анти-IgG кролика	Invitrogen	-11036	1:1000 разбавления
Vectashield	Векторные Labs	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
вакуумной смазки	Рыболов	S41718
Affi-Gel Гель Синий	Bio-Rad	153-7301