Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.
Corti memeli organı mechanosensory saç ve nonsensory destekleyici hücrelerin yüksek sipariş hücresel bir mozaik
(1,2 gözden) bu hücresel mozaik Görselleştirme Corti organı genellikle kesitli olmasını gerektirir. Özellikle, çekirdekleri dorsalde saç hücreleri ile ilgili bulunmaktadır nonsensory ayağı ve Deiters hücreleri, Corti organı kesit alma görüntülendi olamaz. Ancak, sütun ve Deiters hücreleri ince sitoplazmik süreçleri de dahil olmak üzere, memeli Corti organı hassas hücre mimarisini, standart immünohistokimyasal boyama teknikleri ile uyumlu, parafin ve cryo-kesit gibi rutin histolojik prosedürleri korumak için zordur.
İşte ben konfokal mikroskobu ile takip koklea, tüm montaj bu vibratome bölümlerde immünohistokimyasal kesit vibratome oluşan basit ve sağlam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu prosedür, fare bacak tomurcuk, zebrafish bağırsak, karaciğer, pankreas, ve kalp (seçilen örnekler için bkz: 3-6) de dahil olmak üzere birçok organı, immunhistochemical analizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu yordamı Corti embriyo ve yetişkin farelerin 7 hem de mutant ve kontrol organları ayağı hücre sayısı hem de görüntüleme ve quantitificaton sucessful. Bu yöntem, ancak, şu anda yaygın olarak Corti memeli organı incelemek için kullanılan değildir. Corti yetişkin organ ince hücre mimarisini gelişmiş koruma sağlamak ve çeşitli hücre tipleri ölçümü için izin hem de bu işlem için potansiyel açıklanmıştır.
1. Iç kulakları izolasyon ve sabitleme
2. Kesme vibratome bölümleri
3. Antikor boyama vibratome bölümleri
Antikor leke ile devam edin. Bütün montaj Süreç bölümleri, serbest yüzen bir çözüm. Aşağıda Corti organı ayağı hücrelerinin S100 işaretleyici için bir örnek antikor boyama protokolü, ancak protokol herhangi bir antikor için kullanılabilir. Tüm yıkar, aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında yapılır.
4. Slaytlar ve konfokal mikroskobi montaj bölümleri
Lamel ile kalınlığında kesitler kırma önlemek için, ayrı ayrı bölümlerin monte ederken, bir spacer mikroskop slayt ve lamel arasında takılı olmalıdır. Aşağıda kalın vibratome bölümleri montaj iki alternatif yöntemler şunlardır:
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Ayağı ve Deiters hücreleri bulunan ve nükleer bir boya (Şekil 3A-F) ile zıt S100 protein, lekeli bir vibratome bölümü aracılığıyla bir temsilci konfokal z yığını. Her panel panel, 3 mikron adımları alınan konfokal görüntü konfokal görüntü vibratome bölümünde F vibratome bölüm içinde en içten elde konfokal görüntü ve panel yüzeyine yakın aldı. Corti organı morfolojisi minimal kesintiye görünür. Özellikle, ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları kırık değil. Z-yığını (Şekil 3A 3F ile) aracılığıyla ayağı hücre çekirdeğinin görünüm ve ortadan kalkması belirterek, hem iç ve dış ayağı hücre sayısı (- F numaralandırma, Şekil 3A) sayılabilir. Konfokal görüntü başına her hücre tipi sayısının az olması nedeniyle, bu yaklaşım içinde en fazla hücre tipleri Corti organı saymak için kullanılabilir.
Şekil 1 bozulmamış, 15 hafta, yetişkin iç kulakları otik kapsül kaplı. (A) sağ otik kapsül (köşeli ayraç), beyin çıkarıldıktan sonra, kafasının içinde bir noktadan bakıldığında, kafatası kaplı. Anterior hakkı. (B) Bozulmamış, 15 hafta eski iç kafatası diseksiyonu sonra kulakları. Sol iç kulak lateral yüzeyinde görünür; sağ iç kulak medial yüzeyi görünür. Etiketler ön yarı dairesel kanal (asc), eş (koklea) ve ow (oval pencere) yerleri gösterir.
Şekil 2 (A) Tüm Peel-Away kalıp merkezi agaroz gömülü 15 hafta eski bir yetişkin, iç kulak . Bölümünde amaçlanan düzlemde gösterilir. Gömülü önce 15 hafta, bütün iç kulak (B) Close-up görüntü. Membranöz labirent daha net bir izlenenler böylece çevresindeki kemiğin bir kısmı uzakta diseke edilmiştir. Yanal yarı dairesel kanal (LSC), ön yarı dairesel kanal (Artan) ve koklea (co) (beyaz eğrileri) izlenmektedir. Bazal açmak ve koklea (ok ucu) bölümü (kesikli çizgi) amaçlanan düzlemde gösterilir. (C) Temsilcisi Cross-koklea yoluyla bölümü. Koklear kanal aracılığıyla bir kesit, Corti organı (oC) kutulu, stria vascularis (sv), parantez içine alınmış olan ve Reissner membran (Rm) gösterilir.
Şekil 3 P21 at yabani tip fare Corti organı. Bir ayağı hücreleri ve Deiters görselleştirmek için Corti S100 antikor lekeli organ üzerinden 3 mikron adım boyutu, 'hücrelerinde (AF) Sıralı konfokal serisi. Serinin sonuna kadar başından itibaren iç ve dış ayağı hücreleri sayar numaralı. Kısaltmalar: İHK (iç saç hücresi), aIHC (komşu iç saç hücresi), OHC (dış saç hücresi), Bilgisayar (ayağı hücre), DC (Deiters 'hücre).
Immünhistokimya ve konfokal görüntüleme ile takip vibratome kesit, prosedür, minimal doku hasarı ile Corti organı görselleştirme sağlar. Açıkçası, vibratome bölümünde iç bölgelerinden alınan konfokal görüntüler sadece fiksasyon eserler ile sınırlıdır hücresel morfoloji mükemmel koruma göstermektedir. Ara sıra ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları sonları gibi hücresel kesintileri, (gösterilmemiştir) gözlemlenmesine rağmen yakın bir vibratome bölümü iki kesim yüzeyleri a...
Yazar agaroz boncuklar kullanarak bölümleri mount öneri konfokal mikroskopi ve Dr. Jian Zhang Çocuk Araştırma Enstitüsü Imaging Core kullanımı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe DC010387 tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
---|---|---|---|
Leica Blade Mikrotom Titreşimli VT1000S | Leica | ||
Zeiss LSM510 lazer tarama konfokal mikroskop | Zeiss | ||
Öğrenci Dumont # 5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 91150-20 | |
Ultrapure Düşük Erime Noktası Agaroz | Invitrogen | 16520-050 | |
Peel-A-Way gömme kalıp | Polysciences | 18.986 veya 18646A | |
sığır serum albumini | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
Keçi Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
Alexa Fluor 568 keçi anti-tavşan IgG | Invitrogen | A-11.036 | 1:1000 dilüsyon |
Vectashield | Vektör Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
vakum gres | Balıkçı | S41718 | |
Affi-Gel Mavi Jel | Bio-Rad | 153-7301 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır